一種促進(jìn)微藻油脂積累的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藻類生物的培養(yǎng)技術(shù),特別是涉及一種促進(jìn)微藻油脂積累的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著石油等化石燃料的日益枯竭以及其使用過程中所造成的環(huán)境問題,迫使人們開始尋求可持續(xù)發(fā)展的新能源以解決日益增加的能源需求以及日益惡化的環(huán)境問題,而生物柴油不但具有優(yōu)良的環(huán)保特性和燃料性能,而且具有可再生性,已經(jīng)成為未來能源發(fā)展的主方向。生物柴油的原料來源廣泛,傳統(tǒng)原料包括菜籽油、麻風(fēng)樹、文冠果、黃連木和廢棄油脂等。與此相比,用藻類作為原料來生產(chǎn)生物柴油具有無可比擬的優(yōu)越性,其油脂產(chǎn)率能比其它產(chǎn)油作物的油脂產(chǎn)率高出約兩個(gè)數(shù)量級(jí)(Chisti Y.B1diesel frommicroalgae [J].B1technology advances, 2007,25 (3): 294-306 ;胡洪營(yíng),李盡,于茵等譯(美國能源部生物質(zhì)項(xiàng)目署).藻類生物質(zhì)能源-基本原理、關(guān)鍵技術(shù)與發(fā)展路線圖.北京:科學(xué)出版社,2011,2-41),而且可以大幅度節(jié)約耕地面積。藻類是高能量密度、可再生液態(tài)交通燃料的理想生物柴油原料,一方面,微藻分布廣,易培養(yǎng),生長(zhǎng)周期短,生物量高,光合作用效率強(qiáng),并且對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求比較簡(jiǎn)單,能適應(yīng)多種生長(zhǎng)環(huán)境,可以避免對(duì)農(nóng)業(yè)耕地的侵占并且能夠吸收環(huán)境中的溫室效應(yīng)氣體C02。另一方面,微藻可以吸收水體中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素,能有效地降低水體的富營(yíng)養(yǎng)化,對(duì)環(huán)境具有很強(qiáng)的修復(fù)功能(劉建國,龍?jiān)?,黃園,龐通,林偉,李凌.微藻生物柴油研宄現(xiàn)狀與發(fā)展策略[J].海洋科學(xué),2013,37:10)ο
[0003]微藻油脂的積累受諸多因素的影響,如氮源種類、氮源濃度、鹽濃度、溫度和光強(qiáng)等。目前大多采用營(yíng)養(yǎng)元素缺失或外界環(huán)境脅迫的方法提高單個(gè)藻細(xì)胞的油脂含量,但油脂總產(chǎn)率卻因生物量下降而下降,無法達(dá)到人們所期望的水平(Zhang TY1Wu YH, ZhuSF, Li FM, Hu HY, 2013, Isolat1n and heterotrophic cultivat1n of mixotrophicmicroalgae strains for domestic wastewater treatment and lipid product1nunder dark condit1n.B1resource Technology,149:586 - 589 ;Cakmak T,AngunP, Demiray YE, Ozkan AD, Elibol Z, Tekinay T, 2012, Differential Effects of Nitrogenand Sulfur Deprivat1n on Growth and B1diesel Feedstock Product1n ofChlamydomonasreinhardti1.B1technology and B1engineering, 8 (109):1947 - 1957)。
[0004]在脅迫誘導(dǎo)微藻油脂積累的研宄中,pH被認(rèn)為是調(diào)控油脂合成的重要因子之一。Guckert 等(Guckert JB, Cooksey KE, 1990, Triglyceride accumulat1n and fatty acidprofile changes in chlorella during high pH-1nduced cell cycle inhibit1n.Journal of Phycology, 26:72 - 79)發(fā)現(xiàn)堿性pH值的脅迫誘導(dǎo)了小球藻中甘油三醋(TAG)的積累,但同時(shí)也會(huì)對(duì)微藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制。目前為止,尚且沒有一種成熟的pH處理方法可以在提高油脂產(chǎn)量的同時(shí),又不影響微藻的生物量。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為了彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明提出一種促進(jìn)微藻油脂積累的培養(yǎng)方法,其可以在提高微藻油脂產(chǎn)量的同時(shí)又不影響微藻的生物量。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決:
[0007]—種促進(jìn)微藻油脂積累的培養(yǎng)方法,將微藻接種在培養(yǎng)基中培養(yǎng),在所述培養(yǎng)基中添加N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)的緩沖液,添加所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液后所述培養(yǎng)基的PH值始終維持在9.0?10.0之間。
[0008]優(yōu)選地,所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液是在將所述微藻接種到所述培養(yǎng)基時(shí)就添加到所述培養(yǎng)基。
[0009]優(yōu)選地,在將所述微藻接種到所述培養(yǎng)基時(shí),在所述培養(yǎng)基中加入Tris緩沖液,使所述培養(yǎng)基的PH值維持在7.8-8.5之間,然后在所述微藻的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)在所述培養(yǎng)基中再添加所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液,使所述培養(yǎng)基的pH值始終維持在9.0?10.0之間。
[0010]優(yōu)選地,所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30 μΜ-30πιΜ。
[0011]優(yōu)選地,所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液是將N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸、去離子水和NaOH混合制成,所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液中所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的摩爾濃度為0.2Μ?5Μ。
[0012]優(yōu)選地,所述微藻的培養(yǎng)條件為:8h?16h光照與8h?16h黑暗交替,溫度17 V?24 °C,光照強(qiáng)度為 50 μ mo I.m 2.s 1 ?200 μ mo I.m 2^s10
[0013]優(yōu)選地,在初始配制的培養(yǎng)基中,每IL所述培養(yǎng)基中包含如下組分:lmg?10mgNaNO3, Img ?50mg NaH2PO4.2Η20,Img ?50mg Na2EDTA, Img ?50mg FeCl3.6Η20,0.01 μ g ?Img CuSO4.5Η20,0.01 μ g ?Img ZnSO4.7Η20,0.01 μ g ?Img CoCl2.6H2O, 0.01 μ g ?ImgMnCl2.4Η20,0.0001 μ g ?Img Na2MoO4.2Η20,0.0001 μ g ?Img 維生素 Β12,0.01 μ g ?1mg維生素BI和0.0001 μ g?Img維生素H。
[0014]優(yōu)選地,所述微藻為褐指藻屬。
[0015]優(yōu)選地,所述微藻為三角褐指藻藻種。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果是:本發(fā)明在培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中加入CHES緩沖液后能將培養(yǎng)基的pH值始終維持在9.0?10.0之間,一旦加入CHES緩沖液后,無需后期的PH值調(diào)節(jié),操作簡(jiǎn)單易行,節(jié)約勞動(dòng)成本,同時(shí)克服了堿性pH(直接用HCl和NaOH調(diào)節(jié)的)抑制微藻生長(zhǎng)的缺陷,且本發(fā)明能有效提高微藻(尤其是海洋微藻)的細(xì)胞相對(duì)油脂含量(實(shí)驗(yàn)證明比未加CHES緩沖液的增加了 I?5倍)和最終油脂含量(較未加CHES緩沖液的提高10% -40% ),本發(fā)明的培養(yǎng)方法,可以應(yīng)用在微藻的大規(guī)模培養(yǎng)和微藻油脂工程藻的改良中。
【附圖說明】
[0017]圖1A是本發(fā)明實(shí)施例一中測(cè)得的I號(hào)對(duì)照組和2號(hào)處理組對(duì)比的細(xì)胞密度的曲線圖;
[0018]圖1B是本發(fā)明實(shí)施例一中測(cè)得的I號(hào)對(duì)照組和2號(hào)處理組對(duì)比的葉綠素含量的曲線圖。
[0019]圖2A是本發(fā)明實(shí)施例一中測(cè)得的I號(hào)對(duì)照組分別與3?5號(hào)處理組對(duì)比的細(xì)胞密度的曲線圖。
[0020]圖2B是本發(fā)明實(shí)施例一中測(cè)得的I號(hào)對(duì)照組分別與3?5號(hào)處理組對(duì)比的葉綠素含量的曲線圖。
[0021]圖3A?圖3D’是本發(fā)明實(shí)施例二中利用激光共聚焦分別檢測(cè)I號(hào)對(duì)照組與3?5處理組的尼羅紅熒光強(qiáng)度的圖。其中:圖3A、3B、3C和3D分別是I號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)在熒光下拍攝的圖;圖3A’、3B’、3C’和3D’分別是I號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)在熒光拍攝的圖與在白光下拍攝圖的疊加。
[0022]圖4A、4B、4C和4D是本發(fā)明實(shí)施例二中利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)I號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)的尼羅紅焚光強(qiáng)度的圖。
[0023]圖4E是根據(jù)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的I號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)對(duì)比的尼羅紅相對(duì)焚光強(qiáng)度柱狀圖。
[0024]圖5本發(fā)明實(shí)施例二中測(cè)得的I號(hào)對(duì)照組與4?5處理組的油脂含量的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面對(duì)照附圖并結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。需要說明的是:以下實(shí)施用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中,凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的,均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件,例如微藻的葉綠素含量按照浮游植物分類熒光儀ΡΗΥΤ0-ΡΑΜ說明書進(jìn)行檢測(cè)。所有原料均為市銷商品。
[0026]本發(fā)明提供一種促進(jìn)微藻油脂積累的培養(yǎng)方法,在一些【具體實(shí)施方式】中,包括如下步驟:將微藻在培養(yǎng)基中培養(yǎng),在所述培養(yǎng)基中添加CHES的緩沖液,添加所述CHES的緩沖液后所述培養(yǎng)基的PH值始終維持在9.0?10.0之間。
[0027]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述CHES的緩沖液是在將所述微藻接種到所述培養(yǎng)基時(shí)就添加到所述培養(yǎng)基。
[0028]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,在將所述微藻接種到所述培養(yǎng)基時(shí),在所述培養(yǎng)基中加入Tris緩沖液,使所述培養(yǎng)基的pH值維持在7.8-8.5之間,然后在所述微藻的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)在所述培養(yǎng)基中再添加所述CHES的緩沖液,使所述培養(yǎng)基的pH值始終維持在
9.0?10.0之間。
[0029]其中較優(yōu)的是:
[0030]所述CHES的緩沖液在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30 μ M_30mM,這樣的濃度范圍利于一次添加CHES緩沖液后就能維持培養(yǎng)基的pH始終在9.0?10.0之間。
[0031]所述CHES緩沖液是將CHES、去離子水和NaOH混合制成,所述CHES的緩沖液中所述CHES的摩爾濃度為0.2M?5M,也即先將CHES緩沖液配制成0.2M?5M的儲(chǔ)存液備用,然后再將適量的CHES緩沖液加入培養(yǎng)基中。
[0032]所述微藻的培養(yǎng)條件為:8h?16h光照與8h?16h黑暗交替,溫度17°C?24°C,光照