向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，并找出了最佳比例，屬于微藻技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過向天然海水中添加比例為1：10?1：50的消化液作為實驗組培養(yǎng)基，BG11、天然海水、消化液作為對照組，在連續(xù)光照的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至微藻停止生長時，離心分離收獲藻體。結(jié)果表明在添加了消化液的天然海水中培養(yǎng)的微藻的生長速率明顯高于在BG11、純海水中培養(yǎng)的微藻，而且用添加了消化液的天然海水作培養(yǎng)基提高了微藻的油脂產(chǎn)率，降低了微藻的培養(yǎng)成本，值得推廣使用。
【專利說明】
向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消 化液培養(yǎng)微藻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著經(jīng)濟與社會的迅速發(fā)展，人類對煤、石油、天然氣等化石燃料的需求量越來越 高。然而化石燃料的大規(guī)模使用嚴重加劇了能源危機和全球氣候變化，因此，尋求一種新的 可再生能源是迫切需要的。微藻由于具有細胞繁殖快、生長周期短、固碳能力強、光合效率 高、環(huán)境適應(yīng)性強、不占用農(nóng)業(yè)耕地等特點而被廣泛用作生產(chǎn)生物柴油的原材料。然而由于 微藻培養(yǎng)成本高的問題制約了微藻產(chǎn)油的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。因此，尋求一種低成本的微 藻培養(yǎng)基成為研究的熱點和焦點。
[0003] 許多研究者已經(jīng)研究了利用廢水來培養(yǎng)微藻。Ting Cai等人在人工海水中添加了 不同比例的工業(yè)廢水厭氧消化液來培養(yǎng)集胞藻，其中當(dāng)消化液的比例為3%時，集胞藻獲得 最大的生物質(zhì)產(chǎn)率（150· 9±8·6mgL-ld-l)和油脂產(chǎn)率（19·9± 1 · 2mgL-ld-l) (Cai et al ·， 2013) <Jo〇-Young Jung等人用不同比例的天然海水和BGll培養(yǎng)斜生柵藻，其中當(dāng)天然海水 的比例為10%時獲得最大的生物量（l.lg/L)和脂肪酸甲酯產(chǎn)量（9%)(Jung et al.， 2015)。然而配制人工海水和BGl 1需要消耗大量的淡水資源。相比而言，海水，儲量豐富，覆 蓋了地球表面的71%，含有有利于海洋生物生長的豐富的礦物質(zhì)，主要是Na+，Cl-，Mg2+， S042-，Ca2+。其中海水以高鹽度著稱，這有利于刺激微藻油脂的積累，因此利用海水培養(yǎng)微 藻具有很大的發(fā)展前景。然而直接利用海水培養(yǎng)微藻又是不可取的，因為微藻生長除了需 要礦物質(zhì)，還需要氮、磷等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。而海水中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的含量相當(dāng)?shù)停蛔?以滿足微藻生長的需要。餐廚垃圾厭氧消化液是餐廚垃圾中的有機質(zhì)經(jīng)過厭氧消化而得， 里面仍然含有豐富的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)。如果直接排放，會造成嚴重的環(huán)境污染。如果將餐 廚垃圾厭氧消化液添加到海水中作為培養(yǎng)基來培養(yǎng)微藻，海水可以作為微藻油脂積累的誘 導(dǎo)劑，消化液可以作為微藻生長的營養(yǎng)源，從而達到微藻生長和油脂積累的雙贏目的。而且 海水儲量豐富，成本較低，消化液同時也得到了處理。所以用添加了餐廚垃圾厭氧消化液的 天然海水培養(yǎng)微藻是一種經(jīng)濟環(huán)保有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液來培養(yǎng)微藻的方法。該 方法可以很好的解決微藻培養(yǎng)成本高的問題，同時兼顧提高微藻的油脂含量。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下：
[0006] -種向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其特征為包括如下 步驟：
[0007] (1)將小雙色藻SDEC-6置于BGll培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)；
[0008] (2)配制混合培養(yǎng)基，所述混合培養(yǎng)基是由比例為1:10-1:50的餐廚垃圾厭氧消化 液與天然海水組成；
[0009] (3)將步驟（1)制得的藻細胞種子液接種到步驟(2)制得的混合培養(yǎng)基中，接種后 的生物質(zhì)密度為〇. 06-0.07g/L;
[0010] (4)將步驟（3)制得的反應(yīng)裝置置于人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25±1 °C，81ymol photons/m2/s連續(xù)光照。
[0011] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0012] (1)本發(fā)明向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻，天然海水儲量豐富， 成本較低，微藻獲得了比較理想的生長速率，因此本發(fā)明大大降低了微藻培養(yǎng)的成本。
[0013] (2)本發(fā)明向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻，獲得了較高的微藻 的油脂產(chǎn)率，可以作為一種較好的培養(yǎng)方式。
[0014] (3)本發(fā)明向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻，找出了餐廚垃圾厭 氧消化液的最佳添加比例來培養(yǎng)微藻，同時餐廚垃圾厭氧消化液同時也得到了處理，環(huán)保 經(jīng)濟。
【附圖說明】
[0015] 圖1為小雙色藻SDEC-6在添加了不同比例消化液的天然海水中的生長曲線。
[0016] 圖2為小雙色藻SDEC-6在添加了不同比例消化液的天然海水中的油脂積累特性。
【具體實施方式】
[0017] 以下通過實施例的方式對本發(fā)明做進一步闡述。
[0018] 1、藻株，選取培養(yǎng)的微藻種類為小雙色藻SDEC-6，篩選自濟南泉城公園，并保存于 中國淡水澡種庫。
[0019] 2、天然海水，選取自黃海（山東日照海域），經(jīng)0.45μπι醋酸纖維酯濾膜抽濾后可直 接使用，測得其初始水質(zhì)為:TN:10-50mg/L，NH3-N:l-10mg/L，TP :0.01-lmg/L，pH:8-10，Na: 10000-15000mg/L，Mg:1000-1500mg/L，Ca:800-1000mg/L，K:200-500mg/L，Si:60-90mg/L。
[0020] 3、餐廚垃圾厭氧消化液，選取自濟南十方環(huán)保公司，經(jīng)六層紗布過濾后，再以 4500-6000r/min的速度離心8-10min后可用，測得其初始水質(zhì)為412000-300011^/1，順3-N:2000-3000mg/L，TP:10-50mg/L，COD:5000-8000mg/L，pH:8-10。
[0021] 實施例1:小雙色藻SDEC-6的生長特性 [0022] 1、藻體培養(yǎng)過程：
[0023] (1)將小雙色藻SDEC-6置于BGll培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，BGll培養(yǎng)基成分如下： NaN031.5g/L,K2HP0440mg/L,MgS04 · 7H20 75mg/L,CaC12 · 2H20 36mg/L,Citric acid 6mg/L,Ferric ammonium citrate 6mg/L,EDTANa21mg/L,Na2C0320mg/L,A5solution ImL/ L.A5solution:H3B032.86g/L,MnC12 · 4H20 1,86g/L,ZnS04 · 7H20 0.22g/L,Na2Mo04 · 2H20 0.39g/L,CuS04 · 5H20 0.08g/L,Co(N03)2 · 6H20 0.05g/L〇
[0024] (2)將步驟（I)獲得的藻類種子液稀釋十倍后于680nm處其吸光度為0.172,其干重 為0.06-0.07g/L。
[0025] (3)將步驟(2)中獲得的種子液接種到消化液比例為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 的混合培養(yǎng)基中，并以BGl 1、天然海水和消化液為培養(yǎng)基分別作為對照實驗，在人工氣候室 中進行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每天取樣測定生物量并進行水質(zhì)分析。
[0026] (4)待步驟(3)中的藻體停止生長，對藻液進行離心收獲，倒掉上清液，得到藻泥。
[0027] (5)對步驟(4)中的藻泥進行冷凍干燥，獲得干藻粉。
[0028] 2、藻體生物量測定：
[0029] 每日同一時間取20mL藻液在5000r/min條件下離心10min分層，藻泥取出后置于恒 溫干燥箱中60°C下恒溫烘干稱重測定生物量濃度(g/L)。上清液經(jīng)0.45μπι醋酸纖維酯濾膜 超濾用于分析氮磷濃度?？偟臏y定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（HJ636-2012)，氨氮的測定采用納氏試劑分光光度法(HJ535-2009)，總磷的測定采用鉬酸銨分光光 度法(GB11893-89)。
[0030] 3、生物量測定結(jié)果：
[0031] (1)如圖1所示，在單純的消化液中小雙色藻SDEC-6未能生長;在單純的海水中由 于營養(yǎng)物質(zhì)太低，小雙色藻SDEC-6生長比較緩慢。在消化液添加比例為1/10-1/50的天然海 水中，小雙色藻SDEC-6均有生長。
[0032] (2)如表1所示，在消化液添加比例為I/10-1 /50的天然海水中，小雙色藻SDEC-6的 生物量明顯高于在BG11中的生物量;其中在消化液添加比例為1 /30的天然海水中，小雙色 藻SDEC-6的生物量可以達到0.35g/L，平均生物質(zhì)產(chǎn)率為23.33mg/L/d，比生長速率為 0.18(1'
[0033] 4、結(jié)果分析：
[0034]添加1/20-1/40消化液的天然海水可以作為一種比較理想的替代培養(yǎng)基來培養(yǎng)小 雙色藻SDEC-6獲得生物質(zhì)，這是因為在此添加比例范圍內(nèi)中的氮磷濃度比較適合小雙色藻 SDEC-6的生長，而且海水中的NaCl可以增加混合培養(yǎng)基中的鹽濃度從而刺激藻類的代謝活 動加速藻類的生長，同時海水中的高鹽度可以避免其他微生物的入侵。
[0035] 表1小雙色藻SDEC-6在不同培養(yǎng)基中的最終干重、平均生物質(zhì)產(chǎn)率、比生長速率。
[0037]實施例2:小雙色藻SDEC-6的油脂積累特性 [0038] 1、油脂含量測定：
[0039] 稱取約0.1 g實施例1中得到的干藻粉于50mL離心管中，加入IOmL氯仿/甲醇(v/v = 2:1)溶液，用超聲破碎儀處理IOmin(頻率20%)，然后4000r/min離心10min，離心完溶液分 兩相，將上清液轉(zhuǎn)移到60mL分液漏斗中，整個提取過程重復(fù)兩次。根據(jù)油脂提取液的體積， 投加0.9%的氯化鈉溶液(加入體積為油脂提取液的1/5，約4-5mL氯化鈉溶液），充分搖勻 lmin，并靜置15min。測量低相溶液的體積，并取5mL低相溶液于IOmL玻璃試管中，用氮氣吹 干，將玻璃管置于60°C烘箱中烘至恒重(約30min)。
[0040] 穴油脂僉畺彳+管.
[0041]
[0042]式中：LW-基于干重下的油脂含量，g/g
[0043] ml-藻粉干重，g
[0044] m2-帶油脂的IOmL玻璃管干重，g
[0045] m0一IOmL玻璃管干重，g
[0046] V-低相油脂的體積，mL [0047] 3、油脂含量結(jié)果分析：
[0048]如圖2所示，添加不同比例消化液的天然海水中的小雙色藻SDEC-6的油脂含量均 明顯高于在BGll中的油脂含量，這是由于海水中的鹽度有利于刺激藻細胞中油脂的合成。 其中消化液的添加比例為1/40時小雙色藻SDEC-6的油脂含量達到最高（50.13% )，是BGl 1 中油脂含量的1.72倍。當(dāng)消化液的添加比例為1/30時小雙色藻SDEC-6的油脂產(chǎn)率達到最高 (13.36mg/L/d)，是BGll中油脂產(chǎn)率的2.20倍。因此，由油脂積累數(shù)據(jù)可知，添加了餐廚垃圾 厭氧消化液的天然海水可以作為一種低成本的替代培養(yǎng)基培養(yǎng)小雙色藻SDEC-6,所獲得的 油脂遠遠高于在BGll和天然海水中的油脂含量。
[0049] 對比例《用生活污水稀釋餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)色球藻的方法》（申請?zhí)?201610034390.3)中采用餐廚垃圾厭氧消化液為培養(yǎng)基主體，通過添加不同比例的生活污 水來培養(yǎng)色球藻，獲得一定的生物質(zhì)產(chǎn)率和油脂積累，結(jié)果表明，將餐廚垃圾厭氧消化液稀 釋100倍時，其藻體的生物質(zhì)產(chǎn)率(0.0258CT 1)和比生長速率（105.5mg/L/d)達到最大值，將 餐廚垃圾厭氧消化液稀釋10倍時，油脂含量(38.65% )和油脂產(chǎn)率（11.79mg/L/d)達到最大 值。本發(fā)明采用天然海水為培養(yǎng)基主體，通過添加不同比例的餐廚垃圾厭氧消化液來培養(yǎng) 微藻，添加餐廚垃圾厭氧消化液比例為1/30時，其藻體的生物質(zhì)產(chǎn)率(0.0260CT 1)和比生長 速率（180mg/L/d)達到最大值，添加餐廚垃圾厭氧消化液比例為1/40時，油脂含量 (50.13 % )達到最大值，添加餐廚垃圾厭氧消化液比例為1/30時，油脂產(chǎn)率（13.36mg/L/d) 達到最大值。經(jīng)過比較得出，本發(fā)明采用的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微 藻的方法可以明顯提高藻體的生物質(zhì)產(chǎn)率、比生長速率以及油脂含量和油脂產(chǎn)率。而且天 然海水儲存量極大，容易獲取，降低了培養(yǎng)成本，同時有助于微藻產(chǎn)油的大規(guī)模商業(yè)化生 產(chǎn)。
[0050] 以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也 應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其特征為包括如下步 驟： (1) 將小雙色藻SDEC-6置于BG11培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)； (2) 配制混合培養(yǎng)基，所述混合培養(yǎng)基是由比例為1:10-1:50的餐廚垃圾厭氧消化液與 天然海水組成； (3) 將步驟（1)制得的藻細胞種子液接種到步驟(2)制得的混合培養(yǎng)基中，接種后的生 物質(zhì)密度為0.06-0.07g/L; (4) 將步驟(3)制得的反應(yīng)裝置置于人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度25±?Γ，81μ mol photons/m2/s連續(xù)光照。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其 特征在于，步驟(2)中的所述天然海水為通過抽濾去除過其中藻類的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其 特征在于，所述天然海水所用的抽濾濾膜為0.45μπι醋酸纖維酯濾膜。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其 特征在于，所述天然海水中各營養(yǎng)物質(zhì)和礦物質(zhì)的濃度分別為4^1〇-5〇11^/1，順3-^1-10mg/L,TP:0.01-lmg/L,pH:8-10,Na:10000-15000mg/L,Mg:1000-1500mg/L,Ca:800-1000mg/L,K:200-500mg/L,Si:60-90mg/L〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其 特征在于，步驟(2)中的所述餐廚垃圾厭氧消化液為通過六層紗布過濾并離心的。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其 特征在于，對所述餐廚垃圾厭氧消化液離心的速度為4500-6500r/min，持續(xù)時長為8-10min〇7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其 特征在于，所述的餐廚垃圾厭氧消化液的初始水質(zhì)為：了12000-300011^/1，順34 :2000-3000mg/L，TP:10-50mg/L，COD:5000-8000mg/L，pH:8-10。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液培養(yǎng)微藻的方法，其 特征在于，所述步驟(2)中所述混合培養(yǎng)基中的餐廚垃圾厭氧消化液的最佳添加比例為1: 20-1：40〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的向天然海水中添加餐廚垃圾厭氧消化液的方法，其特征在于， 所述步驟(4)的培養(yǎng)周期為12天。
【文檔編號】C12N1/12GK105861312SQ201610323024
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】裴海燕, 張立杰, 胡文容, 蔣麗群, 韓飛, 成娟
【申請人】山東大學(xué)