液更優(yōu)選為NK細(xì)胞培養(yǎng) 液。
[0047] 在培養(yǎng)基中可以添加血清或血漿進(jìn)行培養(yǎng)。它們在培養(yǎng)基中的添加量不受特殊限 制，如大于〇容量％至20容量％，且可以根據(jù)不同的培養(yǎng)階段而改變血清或血漿的用量，優(yōu) 選為5% (體積比）。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血 衆(zhòng)的來源，可以是自己（意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞來源相同）或非自己（意味著與所培養(yǎng)的 細(xì)胞的來源不同）中的任一種，從安全性的觀點出發(fā)，優(yōu)選自己來源的血清或血漿。
[0048] 本發(fā)明的自體NK細(xì)胞增殖的制備使用上述各種成分及培養(yǎng)基來實施。本發(fā)明中 使用的培養(yǎng)培養(yǎng)條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的條件。例如，可在 37°C、5% C02等條件下培養(yǎng)。還可以實施如下等操作：間隔適當(dāng)?shù)臅r間添加新鮮培養(yǎng)基來 稀釋細(xì)胞培養(yǎng)液，或更換培養(yǎng)基，或更換細(xì)胞培養(yǎng)用器材等。
[0049] 本發(fā)明還提供NK細(xì)胞在臨床應(yīng)用中多次的抗腫瘤治療，NK細(xì)胞臨床治療中采取1 個療程4-8次的回輸治療，即每周采集外周血1次，應(yīng)用于1次NK細(xì)胞的回輸，共完成1個 療程的4-8次的治療，將更好地在生物體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答，達(dá)到很好的治療效果。此 外，上述NK細(xì)胞還具有如下優(yōu)點，多次NK細(xì)胞治療將更好地引發(fā)NK細(xì)胞直接殺瘤活性和 抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，并分泌細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用，產(chǎn)生高 效、長期地抗腫瘤免疫效應(yīng)，因此非常利于患者療效的提高和生存期的延長。
[0050] 以下，結(jié)合實施例對本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。
[0051] 實施例一
[0052] 雞尾酒式培養(yǎng)自體自然殺傷細(xì)胞
[0053] 采集腎細(xì)胞癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者30ml外周血（與其 簽署知情同意書），經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心獲得36X 106單個核細(xì)胞，用1.6ml自 體血漿重懸后，加入32ml的CellGro@SCGM細(xì)胞培養(yǎng)基（含有50ng/ml重組人白介素15、 20ng/ml重組人白介素18、20ng/ml重組人白介素21和50ng/ml重組人MHC-I類鏈相關(guān)分 子A)，混勻后加入到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天以上。
[0054] 雞尾酒式激活培養(yǎng)5天后，將自然殺傷細(xì)胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充20mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含500活性單位/mL重組人白介素2)，在37°C、 5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；將NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)袋中，并繼續(xù)補(bǔ)充一倍體積的 新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含500活性單位/mL重組人白介素2)，在37 °C、5 % 0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培 養(yǎng)2-3天；然后自然殺傷細(xì)胞連續(xù)增殖培養(yǎng)到21天，使得細(xì)胞數(shù)達(dá)到30 X 109以上。
[0055] 取10ul NK細(xì)胞液用1 XPBS (pH7. 4)稀釋10倍，稀釋液加入1倍體積的苔盼蘭溶 液，混勻后加入到細(xì)胞計數(shù)板，于倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，藍(lán)色染色的為死細(xì)胞，不染色的 為活細(xì)胞，細(xì)胞活率均達(dá)到98 %以上。圖1結(jié)果顯示，隨著NK細(xì)胞體外培養(yǎng)時間增加，擴(kuò)增 倍數(shù)也不斷增加，五名癌癥患者NK細(xì)胞培養(yǎng)到21天，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均高于1000倍，每位患 者的NK細(xì)胞數(shù)均高于30X 109。
[0056] 取苔盼蘭染色計數(shù)后的0. 6X 106NK細(xì)胞，分三組，第一組分別添加到有20yL FITC標(biāo)記鼠抗人⑶8單抗、20 y L PE標(biāo)記鼠抗人⑶56單抗和20 y L PerCP標(biāo)記鼠抗人⑶16 單抗；第二組分別添加20 y L FITC標(biāo)記鼠抗人⑶3單抗、20 y L PE標(biāo)記鼠抗人⑶4單抗和 20 y L PerCP標(biāo)記鼠抗人⑶25單抗；第三組為同型對照，分別添加到有20 y L FITC標(biāo)記鼠 IgGl、20yL PE標(biāo)記鼠IgGl和20yL PerCP標(biāo)記鼠IgGl。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后 用lmL的1 X磷酸鹽緩沖液（PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的1 X PBS重懸洗滌后的細(xì)胞， 所得洗滌后的細(xì)胞用FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測。圖2結(jié)果顯示，腎 細(xì)胞癌患者雞尾酒式培養(yǎng)的NK細(xì)胞表型為⑶56+/⑶16+細(xì)胞為90. 82 %，而⑶3+細(xì)胞為 9. 95%、⑶3+/⑶8+細(xì)胞為6. 68%和⑶4+/⑶25+細(xì)胞為4. 12%，表明自體外周血單個核細(xì) 胞經(jīng)雞尾酒式激活培養(yǎng)后獲得NK細(xì)胞⑶56+/⑶16+含量很高。
[0057] 其他四位癌癥患者的外周血單個核細(xì)胞經(jīng)雞尾酒式培養(yǎng)獲得的NK細(xì)胞，同樣流 式細(xì)胞儀檢測后⑶56+/⑶16+表型均大于80 %，⑶3+細(xì)胞低于10 %。
[0058] 實施例二
[0059] 雞尾酒式培養(yǎng)自體自然殺傷細(xì)胞的試劑盒
[0060] (1) 200ml淋巴細(xì)胞分離液；
[0061] (2) 500ml淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基；
[0062] (3)雞尾酒式培養(yǎng)試劑：10ng-50ng/ml重組人白介素15、10ng-50ng/ml重組人白 介素18、10ng_50ng/ml重組人白介素21、10ng_50ng/ml重組人白介素12、10ng_50ng/ml重 組人白介素7以及10ng-50ng/ml重組人MHC-I類鏈相關(guān)分子A中三種以上細(xì)胞因子；
[0063] (4) 50-500活性單位/mL重組人白介素2 ;
[0064] (5) 100ml 生理鹽水；
[0065] (6)使用說明書；
[0066] 其中，所述使用說明書包括實施例1所述的方法。
[0067] 分裝后進(jìn)行包裝，得到雞尾酒式培養(yǎng)自體自然殺傷細(xì)胞的試劑盒。
[0068] 實施例三
[0069] NK細(xì)胞體外殺瘤試驗
[0070] 選擇相應(yīng)的腎細(xì)胞癌（RCC925)和腦膠質(zhì)瘤（U87MG)作為靶細(xì)胞，靶細(xì)胞用RPMI 1640 (含10%小牛血清）重懸到2X105的濃度，以每孔2X10 4個標(biāo)記的靶細(xì)胞（0. lmL)添 加到96孔板的孔中。
[0071] 根據(jù)細(xì)胞免疫學(xué)雜志報道的共表達(dá)4-1BBL和鼠MICA的工程化K562細(xì)胞聯(lián)合 可溶性 IL-21 增殖 NK 細(xì)胞培養(yǎng)（Bo Jiang，Xuan Wu，Xi-ning Li，et al. Expansion of NK cells by engineered K562cells co-expressing 4-1BBL and mMICA， combined with soluble IL-21. Cellular Immunology 290(2014) :10-20)中的現(xiàn)有技術(shù)，制備 NK 細(xì)胞作 為對比例。
[0072] 將實施例一中制備的NK細(xì)胞和現(xiàn)有技術(shù)制備的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別 以2. 5 : 1、5 : 1、10 : 1、20 : 1和40 : 1的效靶比加入對應(yīng)的孔中，在37°C孵育4 小時。孵育后，用通過CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性試劑盒檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH)釋放分析的（美國Promega公司）。效應(yīng)細(xì)胞和革El細(xì)胞比例為2.5 : 1， 5 : 1，10 : 1，20 : 1與40 : 1，依據(jù)下面公式進(jìn)行計算細(xì)胞毒性活性的。
【主權(quán)項】
1. 一種自體自然殺傷細(xì)胞雞尾酒式培養(yǎng)的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟： 來自于癌癥患者30ml外周血的單個核細(xì)胞，在含有重組人白介素15、重組人白介素18、重 組人白介素21、重組人白介素12、重組人白介素7以及重組人MHC-I類鏈相關(guān)分子A中三 種以上細(xì)胞因子共同作用下激活自然殺傷細(xì)胞大量增殖