一種快速檢測(cè)禽源樣品中沙門菌的lamp試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)禽源樣品中沙門菌的 LAMP試劑盒，具體為一種快速檢測(cè)禽源樣品中雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌與腸炎沙門菌 的LAMP試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門菌（Salmonella)是腸桿菌科中最常見的人畜共患病原菌，常寄生于動(dòng)物和 人體腸道內(nèi)。由沙門菌引起的食物中毒是所有細(xì)菌性食物中毒中比例最高，危害最廣的一 種。沙門菌感染的禽群，是那些能夠通過食物鏈傳給人的沙門菌最為常見的儲(chǔ)存庫之一。 從家禽和禽產(chǎn)品中分離出沙門菌的報(bào)道明顯多于其它動(dòng)物，造成這一結(jié)果的主要原因是由 于沙門菌在被感染的家禽中能通過水平傳播和垂直傳播造成廣泛流行，同時(shí)也反映出家禽 的飼養(yǎng)數(shù)量十分龐大。大量的研宄數(shù)據(jù)表明，不同宿主來源的沙門菌血清型存在較大的差 異，對(duì)禽源沙門菌的流行病學(xué)研宄表明，其優(yōu)勢(shì)血清型主要集中于雞白痢沙門菌、雞傷寒沙 門菌、腸炎沙門菌等幾種嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)與人類健康的血清型，因而針對(duì)上述禽源優(yōu) 勢(shì)血清型沙門菌開發(fā)特異性的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于防控禽源沙門菌的傳播具有重要的意義。
[0003] 由于傳統(tǒng)的沙門菌檢測(cè)技術(shù)上存在諸多缺陷，如：操作步驟煩瑣耗時(shí)，現(xiàn)行的國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)沙門菌的檢測(cè)通常需要4-6天，已不能滿足及時(shí)有效的質(zhì)量監(jiān)測(cè)和疾 病防控需求；靈敏度較低，當(dāng)樣品中沙門菌含量較低時(shí)，易造成假陰性結(jié)果；準(zhǔn)確度不高， 尤其是加工后的食品受加熱、干燥、高鹽和冷凍等因素的作用，易導(dǎo)致沙門菌形成營(yíng)養(yǎng)缺陷 型，用傳統(tǒng)方法不易檢出。因此，迫切需要研發(fā)操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速的檢測(cè)技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增技術(shù)（LAMP)是一種新型的分子檢測(cè)方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特 異引物，利用鏈置換型DNA聚合酶，能在等溫條件下（60~65°C )、Ih內(nèi)特異地?cái)U(kuò)增出IO9~ 101°拷貝靶序列。在保持傳統(tǒng)PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性，同時(shí)縮 短了檢測(cè)時(shí)間。現(xiàn)已被應(yīng)用于多種病原微生物的檢測(cè)和研宄，并具有良好的發(fā)展前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有沙門菌檢測(cè)技術(shù)上存在諸多缺陷，旨在提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確 的檢測(cè)禽源樣品中沙門菌的LAMP試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單的 特點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明另一目的在于提供一種用于檢測(cè)沙門菌的通用LAMP引物組。
[0006] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種快速檢測(cè)禽源樣品中沙門菌的LAMP試劑盒，包括：
[0008] I) 10 X LAMP 緩沖液；
[0009] 2) 8000U/mL BstDNA 聚合酶；
[0010] 3) IOmMdNTPs;
[0011] 4)LAMP引物組：外引物濃度為Spmol/yL，外引物為F3和B3 ;內(nèi)引物濃度為 40pmol/ μ L，內(nèi)引物為FIP和BIP ;環(huán)引物濃度為20pmol/ μ L，環(huán)引物為L(zhǎng)F和LB ;
[0012] 5)無菌去離子水；
[0013] 6)熒光染料：10 X SYBR Green I ;
[0014] 7)陽性對(duì)照：腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13076基因組DNA ;
[0015] 8)陰性對(duì)照：無菌去離子水。
[0016] 所述的 10XLAMP 緩沖液含有 200mM Tris-HCl(pH 8.8,25°C )、100mM 氯化鉀、 IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂、8M甜菜堿和體積百分濃度為1 %的曲拉通X-100。
[0017] 所述的外引物F3和B3序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，所述的內(nèi)引物 FIP和BIP序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，所述的環(huán)引物L(fēng)F和LB序列如SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
[0018] 本發(fā)明待檢樣品基因組DNA按常規(guī)方法提取或試劑盒提取。
[0019] 本發(fā)明試劑盒LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系為：每25 yL反應(yīng)液中，5pmol/yL的F3和B3 各 1 μ L，40pmol/ μ L 的 FIP 和 BIP 各 1 μ L，20pmol/ μ L 的 LF 和 LB 各 1 μ L，Bst DNA 聚合 酶1 μ L，lOmmol/L的dNTPs 3. 5 μ L，待檢樣品DNA 2~3 μ L，無菌去離子水適量。
[0020] 本發(fā)明試劑盒采用熒光目視法時(shí)，需在反應(yīng)體系中添加10XSYBR Green I 2. 5 μ L，反應(yīng)體系總量保持25. 0 μ L不變。
[0021] 本發(fā)明LAMP反應(yīng)條件為：66°C恒溫反應(yīng)50min，并在80°C持續(xù)10min。
[0022] 本發(fā)明所述的沙門菌為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌或腸炎沙門菌中的一種或幾 種。
[0023] 本發(fā)明試劑盒反應(yīng)完成后肉眼觀察液體變混濁（如果加入熒光染料則顏色由橙 色變?yōu)榫G色），則說明樣品中含有雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌與腸炎沙門菌中的一種或幾 種；或使用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽性則可呈現(xiàn)典型的特異梯狀條帶，陰性則無此 現(xiàn)象。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)沙門菌的通用LAMP引物組，包括：外引物F3和B3 ; 內(nèi)引物FIP和BIP ;環(huán)引物L(fēng)F和LB。
[0025] 所述的沙門菌為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌或腸炎沙門菌中的一種或幾種。
[0026] 本發(fā)明的試劑盒LAMP檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] 1)快速高效：整個(gè)擴(kuò)增過程僅需35~50min，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9~10 1(1個(gè)拷貝靶 序列；
[0028] 2)操作便捷：不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變 性等繁瑣步驟，只需要普通水浴鍋即可進(jìn)行檢測(cè)；
[0029] 3)特異性強(qiáng)：本發(fā)明根據(jù)三種禽源沙門菌（雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌與腸炎 沙門菌）含有的特異基因序列設(shè)計(jì)6條特異性引物，應(yīng)用上述引物，擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū) 域，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定， 形成引物二聚體概率低，確保反應(yīng)的順利進(jìn)行；
[0030] 4)靈敏度高：最低檢測(cè)極限可達(dá)到0. 5~0. 6pg/管，比普通PCR高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)；
[0031] 5)適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)：肉眼觀察液體變渾濁即為陽性，澄清透明則為陰性；若采用熒 光目視法觀察顏色變化，顏色變?yōu)榫G色為陽性，橙色為陰性；或使用2 %濃度瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)，陽性可呈現(xiàn)典型的特異梯狀條帶，陰性無此現(xiàn)象。
[0032] 本發(fā)明的LAMP檢測(cè)方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合現(xiàn)場(chǎng) 檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，不需要配置相關(guān)檢測(cè)儀器，為禽源沙門菌的檢測(cè)提供了新的技術(shù)支撐，可用于 畜牧業(yè)生產(chǎn)單位、獸醫(yī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、屠宰場(chǎng)、出入境和各疾病預(yù)防控制中心篩查和檢測(cè)，具 有廣闊的市場(chǎng)前景，適于推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的外引物與內(nèi)引物比例優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果圖；M為 DL-5000marker，泳道號(hào)1-6分別為外、內(nèi)引物比1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,1:10,泳道7為陰性 對(duì)照；
[0034] 圖2為本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的外引物與環(huán)引物比例優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果圖；M為 DL-5000marker，泳道號(hào)1-6為外、環(huán)引物比1: 1，1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,泳道7為陰性對(duì) 昭.
[0035] 圖3為本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的引物缺省試驗(yàn)結(jié)果圖；M為DL-5000marker ;1-11分 另IJ為引物內(nèi)外環(huán)引物全有、；無上游外引物F3 ;無下游外引物B3 ;無上、下游外引物F3、B3 ; 無上游內(nèi)引物FIP ;無下游內(nèi)引物BIP ;無上、下游內(nèi)引物FIP、BIP ;無上游環(huán)引物L(fēng)F ;無下 游環(huán)引物L(fēng)B ;無上、下游環(huán)引物L(fēng)F、LB ;內(nèi)外環(huán)引物都無；泳道12為陰性對(duì)照；
[0036] 圖4為本發(fā)明LAMP檢測(cè)體系中不同濃度Mg2+試驗(yàn)結(jié)果圖；M為DL-5000marker ; 1-6 分別為濃度 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM 的 MgS04;7 為陰性對(duì)照；
[0037] 圖5為本發(fā)明LAMP檢測(cè)體系中不同濃度Bst DNA聚合酶試驗(yàn)結(jié)果圖；M為 DL_5000marker ; 1-6 分別對(duì)應(yīng) BstDNApolymerase 添加量依次為 0· 4、0· 6、0· 8、1. 0、1· 2、 1. 4 μ L ;7為陰性對(duì)照；
[0038] 圖6為本發(fā)明LAMP檢測(cè)體系中不同濃度dNTPs試驗(yàn)結(jié)果圖；M為DL-5000marker ; 1-7分別對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系