多重pcr檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和動物檢疫技術領域，具體涉及一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲 和微孢子蟲的檢測方法，尤其涉及一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的多重PCR 檢測方法及試劑盒。此外，本發(fā)明涉及用于同時檢測隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子 蟲的引物。
【背景技術】
[0002] 隱孢子蟲、藍氏賈第鞭毛蟲（簡稱賈第蟲）、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲為人獸共患新發(fā) 腸道原蟲，主要介水傳播，引起消耗性腹瀉，是全球面臨的重要公共衛(wèi)生問題，也是人類迄 今為止面臨的最困難的問題之一；可暴發(fā)流行，造成嚴重的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。人的感染 主要是攝入被卵囊/包囊等污染的飲水和食物，引起的疾病以腹瀉為主要臨床癥狀，呈全 球分布，也是艾滋病患者死亡的主要病因之一。免疫功能正常人群感染，常可引起急性、自 限性腹瀉，嬰幼兒、免疫功能缺陷或免疫抑制人群感染，可引起慢性消耗性腹瀉，甚至死亡。 該類疾病可從動物傳播到人，人傳播到動物，并在動物與動物、人與人之間廣泛傳播，造成 重大經(jīng)濟影響。每年全球有250萬5歲以下的兒童因包括腸道原蟲在內(nèi)的腸道病原體感 染引起的腹瀉而死亡。我國隱孢子蟲感染率〇. 5%~13. 5%，賈第蟲為2. 52%，環(huán)孢子蟲 為0. 3~10. 6%，其中臨床腹瀉患者環(huán)孢子蟲感染率為1. 71~2. 47%;上海某醫(yī)院腹瀉患 者微孢子蟲的感染率高達13. 49%。其中隱孢子蟲病已被WHO列入全球六大腹瀉病之一， 于1986年將隱孢子蟲作為AIDS (艾滋?。┗颊叩囊豁棏岩芍笜?，并被WHO和美國CDC列入 新發(fā)傳染病，隱孢子蟲病越來越引起關注，已被列為美國政府生物恐怖制劑名單的第三位 (http://www. nsf. org/consumer/bioterrorism/bioterrorism_agents. asp)，也是其中唯 一一種寄生蟲病原。隱孢子蟲、環(huán)孢子蟲是美國FoodNet食源性疾病監(jiān)測十大病原之一，位 列第二和第九位；而隱孢子蟲和賈第蟲是我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》水質(zhì)必檢指標之一， 也是我國國家科技重大專項一一國家傳染病監(jiān)測技術平臺監(jiān)測的病原。另外，2013年春夏 之交，美國暴發(fā)了因食物污染引起的環(huán)孢子蟲病，遍布25個州643人感染；且90%以上的 環(huán)孢子蟲感染與食物污染有關。
[0003] 有資料顯示水中只要含有1個卵囊就可引起隱孢子蟲病傳播流行。但是國內(nèi)由于 對其研宄起步較晚，基本仍采用形態(tài)學檢測，易漏檢、誤檢?？焖贆z測工具的缺乏，無檢測試 劑盒，更無高通量檢測技術，嚴重制約了對這類新發(fā)腸道原蟲的監(jiān)測和研宄。
[0004] 隨著分子生物學技術的發(fā)展，基于不同的分子標識，可實現(xiàn)對該類腸道原蟲的檢 測和鑒定。但單一蟲種檢測，成本昂貴，費時費力。自1988年Chamberian首次將多重 PCR(Multiplex PCR)技術用于人的杜氏營養(yǎng)不良癥（DMD)的檢測，現(xiàn)已用于傳染病的檢 測。目前，應用多重PCR技術對感染性疾病病原檢測主要有兩個方向：一是針對每一種病原 的單個特異基因進行多重檢測，可同時檢測一種或幾種病原體是否存在；二是針對某一病 原的多個基因進行多重檢測，可以減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。
[0005] Lee等建立了一種檢測水中隱孢子蟲，微孢子蟲和環(huán)孢子蟲的多重PCR檢測 方法(Lee, S. H, Joung, Μ, Yoon, S, et al. Multiplex PCR detection of waterborne intestinal protozoa:microsporidia, Cyclospora, and Cryptosporidium. Korean J Parasitol, 2010, 48 (4) : 297-301)，該方法的最低檢出率是10-100個卵囊或子孢子；Li 等建立了用于檢測隱孢子蟲和賈第蟲的兩重PCR方法（Li W，Zhang N，Gong，P，et al.A novel multiplex PCR coupled with Luminex assay for the simultaneous detection of Cryptosporidium spp. , Cryptosporidium parvum and Giardia duodenal is. Vet Parasitol, 2010, 173 (1-2) : 11-18)，并與Luminex液相芯片檢測技術相結(jié)合，并能檢測出 微小隱孢子蟲，該方法的敏感性可檢測至5*l(T6ng DNA(即0.1個卵囊/包囊）。目前尚無 同時檢測糞便樣本中隱孢子蟲、微孢子蟲，環(huán)孢子蟲和賈第蟲四種原蟲的多重PCR方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題之一在于提供一種多重PCR檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒。 本發(fā)明以隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲四種原蟲為研宄對象，建立了一種快速， 敏感，特異的檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題之二在于提供一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢 子蟲四種原蟲的多重PCR檢測方法。四種腸道原蟲多重PCR方法的建立，解決了進行多次 PCR檢測的繁瑣步驟，一次反應可以達到同時檢測多個基因，明確病原體的作用，大大減輕 了工作量，縮短了檢測時間，降低了檢測成本，具備更大的發(fā)展趨勢。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0009] 在本發(fā)明的一方面，提供一種多重PCR檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒，其用于同時檢 測隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲，該試劑盒包括如下引物：
[0010] 隱孢子蟲的特異性引物：
[0011] Cry-F :5' -TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3'，SEQ ID NO. 1 ;
[0012] Cry-R :5' -CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3'，SEQ ID NO. 2 ;
[0013] 賈第蟲的特異性引物：
[0014] Gia-F :5' -AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3'，SEQ ID NO. 3 ;
[0015] Gia-R :5' -GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3'，SEQ ID NO. 4 ;
[0016] 環(huán)孢子蟲的特異性引物：
[0017] Cycl-F :5' -GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3'，SEQ ID NO. 5 ;
[0018] Cycl-R :5' -CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3'，SEQ ID NO. 6 ;
[0019] 微孢子蟲的特異性引物：
[0020] Micro-F :5, -ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3，，SEQ ID NO. 7 ;
[0021] Micro-R :5' -CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3'，SEQ ID NO. 8。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的多重 PCR檢測方法，具體步驟包括如下：
[0023] (1)隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的蟲體DNA提?。?br>[0024] (2)引物設計與篩選；所述設計的引物序列為：
[0025] 隱孢子蟲的特異性引物：
[0026] Cry-F :5' -TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3'，SEQ ID NO. 1 ;
[0027] Cry-R :5, -CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3,，SEQ ID NO. 2 ;
[0028] 賈第蟲的特異性引物：
[0029] Gia-F :5' -AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3'，SEQ ID NO. 3 ;
[0030] Gia-R :5' -GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3'，SEQ ID NO. 4 ;
[0031] 環(huán)孢子蟲的特異性引物：
[0032] Cycl-F :5' -GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3'，SEQ ID NO. 5 ;
[0033] Cycl-R :5' -CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3'，SEQ ID NO. 6 ;
[0034] 微孢子蟲的特異性引物：
[0035] Micro-F :5' -ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3'，SEQ ID NO. 7 ;
[0036] Micro-R :5' -CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3'，SEQ ID NO. 8 ;
[0037] (3)質(zhì)粒構(gòu)建；
[0038] (4)建立多重PCR方法，對所設計的引物進行PCR反應條件優(yōu)化，得到最佳多重 PCR模式；
[0039] (5)按照步驟（4)的PCR反應條件進行PCR擴增特異性驗證；
[0040] (6)按照步驟（4)的PCR反應條件進行PCR敏感性驗證；
[0041] (7)按照建立的多重PCR方法對樣本進行檢測和可行性驗證。
[0042] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，步驟（3)具體為：將隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和 微孢子蟲進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物回收連接到pMD19-T載體，第二天進行轉(zhuǎn)化；以單菌落為 模板進行PCR擴增，每個培養(yǎng)板各挑取5個菌落，每個樣本接1個陽性菌落，37°C，過夜培 養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，并將PCR結(jié)果正確的質(zhì)粒送測序。
[0043] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，步驟（4)中，所述的PCR反應條件優(yōu)化具體方法為： 退火溫度根據(jù)引物合成后參考溫度，選取57°C、60°C進行PCR，根據(jù)擴增效果確定退火溫 度，最后確定最佳的多重PCR模式。退火溫度優(yōu)選為60°C。
[0044] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，步驟（4)中，所述最佳多重PCR模式具體為：最佳多 重PCR反應體系：30yL反應體系中CldH 2O 6yL，PCR-Mix 15yL，隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子 蟲和微孢子蟲上下游引物各0. 5 yL ;Mgcl23yL，模板DNA 2 yL ;最佳的多重PCR反應條件 為：95。〇311^11;95。〇3〇8,70。〇3〇8,72。〇3〇8,4個循環(huán) ；95。〇3〇8、68。〇3〇8、72。〇3〇8,4個循 環(huán)；95°C 30s、60°C 30s、72°C 30s，40 個循環(huán)；72°C 10min。
[0045] 在本發(fā)明的另一方面，提供用于同時檢測隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲 的引物組，其序列為：
[0046] 隱孢子蟲的特異性引物：
[0047] Cry-F :5' -TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3'，SEQ ID NO. 1 ;
[0048] Cry-R :5, -CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3,，SEQ ID NO. 2 ;
[0049] 賈第蟲的特異性引物：
[0050] Gia-F :5' -AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3'，SEQ ID NO. 3 ;
[0051] Gia-R :5' -GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3'，SEQ ID NO. 4 ;
[0052] 環(huán)孢子蟲的特異性引物：
[0053] Cycl-F :5' -GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3'，SEQ ID NO. 5 ;
[0054] Cycl-R :5' -CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3'，SEQ ID NO. 6 ;
[0055] 微孢子蟲的特異性引物：
[0056] Micro-F :5, -ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3，，SEQ ID NO. 7 ;
[0057] Micro-R :5' -CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3'，SEQ ID NO. 8〇
[0058] 在本發(fā)明的另一方面，提供上述引物在制備多重PCR檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒中 的應