一種二聯(lián)手足口病滅活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口?。℉andfootandmouthdiseaseHFMD)是一種兒童傳染病，又名發(fā)瘆性 水皰性口腔炎。多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰瘆，該病以手、足和 口腔粘膜皰瘆或破潰后形成潰瘍?yōu)橹饕R床癥狀。少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性 腦膜腦炎等并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒如果病情發(fā)展快，導(dǎo)還會(huì)導(dǎo)致死亡。
[0003] 手足口病是由腸道病毒引起的傳染病，腸道病毒傳染性強(qiáng)，傳播途徑廣泛，流行范 圍廣，傳播快，其疾病的流行在一年四季均可出現(xiàn)，且有周期性流行的特點(diǎn)。人是腸道病毒 唯一的自然宿主，主要傳染源為患病者、病毒攜帶者及隱性感染者。引發(fā)手足口病的腸道病 毒有20多種（型），其中以A組的柯薩奇病毒A組16型（Coxsachievirus，CA16)和腸道病 毒71型（Enterovirus71，EV71)最為常見。1972~1973年、1986年和1999年澳大利亞均 發(fā)生過EV71流行，重癥病人大多伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（CNS)，一些病人還有嚴(yán)重的呼吸 系統(tǒng)癥狀。20世紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼暴發(fā)以CNS為主要臨床特征的EV71 流行，僅保加利亞就超過750例發(fā)病，149人致癱，44人死亡。日本是手足口病發(fā)病較多的國(guó) 家，歷史上有過多次大規(guī)模流行，1969~1970年的流行以CA16感染為主，1973和1978年 的2次流行均為EV71引起，主要臨床癥狀為手足口病，病情一般較溫和，但同時(shí)也觀察到伴 無菌性腦膜炎的病例。1997~2000年手足口病在日本再度流行，EV71、CoxA16均有分離， EV71毒株的基因型也與以往不同。20世紀(jì)90年代后期，EV71開始肆虐東亞地區(qū)。1997年 馬來西亞發(fā)生了主要由EV71引起的手足口病流行，4~8月共有2628例發(fā)病，僅4~6月 就有29例病人死亡。死者平均年齡1. 5歲，病程僅2天，100%發(fā)熱，62%手足皮瘆，66% 口 腔潰瘍，28 %病癥發(fā)展迅速，17 %肢軟癱，17例胸片顯示肺水腫。
[0004] 我國(guó)自1981年在上海始見手足口病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、安 徽、廣東等省市均有報(bào)道。2008年安徽阜陽、山東菏澤、河南多地集中暴發(fā)流行手足口病， 并造成多例患兒死亡。自2008年5月2日起，手足口病被國(guó)家納入丙類傳染病管理。近 年來我國(guó)手足口病發(fā)病率及死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)，據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)：2011年全國(guó)共報(bào)告發(fā) 病人數(shù)是，1619706例，死亡病例509例，2012年全國(guó)共報(bào)告發(fā)病數(shù)2198442例，死亡數(shù)569 例。EV71和CoxA16引起的手足口病存在隱性感染和輕癥病例多，傳染源難以發(fā)現(xiàn)和控制， 兒童普遍易感，傳播途徑多，難以有效阻斷等特征，且目前手足口病大都僅是依靠常用阿昔 洛韋、伐昔洛韋、泛昔洛韋等高效廣譜的抗病毒藥物來縮短發(fā)熱及皮損愈合時(shí)間、減輕口腔 皰瘆疼痛，至今還沒有針對(duì)預(yù)防該病的特異性治療藥物。因此研制手足口病疫苗對(duì)預(yù)防手 足口病的發(fā)生具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供兩種手足口病病毒株以及由該兩種病毒株制備的二聯(lián)手足 口病滅活疫苗，所述二聯(lián)手足口病滅活疫苗預(yù)防手足口病，預(yù)防免疫效果佳，安全性好。
[0006] 本發(fā)明提供的一種人腸道71型病毒株CC-09,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7753。
[0007] 本發(fā)明提供的另一種柯薩奇A16型病毒株CC-16,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7752。
[0008] 本發(fā)明通過顱腔注射所述人腸道71型病毒株CC-09病毒和柯薩奇A16型病毒株 CC-16病毒的方法對(duì)1日齡ICR乳鼠進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示3天即可發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)精神狀態(tài) 不佳，行動(dòng)遲緩、嗜睡等臨床癥狀，4天個(gè)別小鼠出現(xiàn)四肢癱瘓的典型手足口臨床癥狀，隨后 其他小鼠也都表現(xiàn)出四肢癱瘓的癥狀，6天時(shí)開始出現(xiàn)死亡，第7天小鼠無存活，而對(duì)照組 小鼠無臨床癥狀表現(xiàn)。表明本發(fā)明所述人腸道71型病毒株CC-09和柯薩奇A16型病毒株 CC-16兩株病毒為強(qiáng)毒株。
[0009] 本發(fā)明還提供由上述兩種手足口病病毒株制備的手足口病疫苗。
[0010] 所述的手足口病疫苗，作為優(yōu)選，為二聯(lián)滅活疫苗。
[0011] 本發(fā)明還提供一種二聯(lián)手足口病滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
[0012] 步驟1:將保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7753的人腸道71型病毒株CC-09和保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 7752的柯薩奇A16型病毒株CC-16分別接種于擴(kuò)大傳代培養(yǎng)的Vero細(xì)胞或人胚 肺二倍體細(xì)胞中培養(yǎng)；
[0013] 步驟2:分別收獲兩種病毒培養(yǎng)液，除雜質(zhì)后濃縮、滅活、純化得到兩種病毒原液； [0014]步驟3:取步驟2制備的兩種病毒原液除菌，混合即得所述二聯(lián)手足口病滅活疫 苗。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟1所述培養(yǎng)為33°C~36°C培養(yǎng)72~120小時(shí)。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟2所述滅活為用甲醛溶液或丙內(nèi)酯溶液滅活。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟2所述純化為陰離子交換層析、分子篩凝膠過濾層析、復(fù)合模式介 質(zhì)層析中的一種或多種。
[0018] 進(jìn)一步的，步驟2所述純化為先采用陰離子交換層析再采用分子篩凝膠過濾層 析。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟3所述除菌為經(jīng)0. 2ym濾膜除菌。
[0020] 作為優(yōu)選，步驟3所述混合為將除菌后的兩種病毒原液混合后吸附佐劑；或者為 將除菌后的兩種病毒原液分別吸附佐劑然后再混合。其中，所述佐劑優(yōu)選為氫氧化鋁溶液。
[0021] 本發(fā)明通過小鼠體內(nèi)效力試驗(yàn)證明本發(fā)明所述二聯(lián)手足口病滅活疫苗針對(duì)兩種 病毒產(chǎn)生了較高的抗體效價(jià)，免疫原性強(qiáng)，且兩種病毒間無交叉抑制作用。
[0022] 本發(fā)明所述由人腸道71型病毒株CC-09和柯薩奇A16型病毒株CC-16混合制成 的二聯(lián)手足口病滅活疫苗，針對(duì)兩種病毒產(chǎn)生了較高的抗體效價(jià)，免疫原性強(qiáng)，且兩種病毒 間無交叉抑制作用，并對(duì)不同地區(qū)病毒有廣泛的中和保護(hù)作用。可有效預(yù)防目前國(guó)內(nèi)流行 的手足口病。本發(fā)明所述二聯(lián)手足口病滅活疫苗其制備工藝簡(jiǎn)單，有效地去除了宿主蛋白 和DNA，病毒純度高，疫苗安全性好，生產(chǎn)成本低，適合疫苗的規(guī)?；a(chǎn)，具有良好的應(yīng)用 前景。
[0023] 生物保藏信息：
[0024] 病毒株CC-09:分類命名：腸道病毒71型，于2013年6月13日保藏在中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué) 院微生物研宄所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7753。
[0025] 病毒株CC-16:分類命名：柯薩奇A16型病毒，于2013年6月13日保藏在中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó) 科學(xué)院微生物研宄所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7752。
【具體實(shí)施方式】：
[0026] 本發(fā)明公開了人腸道71型病毒株CC-09和柯薩奇A16型病毒株CC-16及用所述 兩種病毒株制備的二聯(lián)手足口病滅活疫苗及其制備方法。特別需要指出的是，所有類似的 替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的 產(chǎn)品、方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和 范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0027] 針對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)手足口病的流行趨勢(shì)，為更好的預(yù)防手足口病的爆發(fā)，發(fā)明人經(jīng)過 多年的不懈努力，最終篩選出具有廣泛交叉保護(hù)作用的人腸道71型病毒株CC-09和柯薩奇 A16型病毒株CC-16,建立三級(jí)病毒種子庫，經(jīng)檢定合格后作為疫苗生產(chǎn)用種子庫。對(duì)于上 述病毒株，申請(qǐng)人于2013年6月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，其中人腸道71型病毒株CC-09的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7753,柯薩奇A16型病毒株 CC-16的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7752。
[0028] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了用于預(yù)防手足口病的疫苗。一種手足口病疫 苗，由保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7753的人腸道71型病毒株CC-09和保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7752 的柯薩奇A16型病毒株CC-16制備得到。本發(fā)明所述手足口病疫苗可以更廣泛的用于預(yù)防 EV71病毒和CA16病毒引起的手足口病。疫苗是預(yù)防接種工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。按其性質(zhì) 劃分，可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、組分疫苗、重組基因工程疫苗等，作為優(yōu)選，本發(fā)明所 述手足口病疫苗為二聯(lián)滅活疫苗，更適合于嬰幼兒的免疫預(yù)防。
[0029] 為更好的生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)量二聯(lián)滅活疫苗，本發(fā)明還