一種滅活疫苗滅活程度的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種滅活疫苗滅活程度的檢測(cè)方法，屬于生物制品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]滅活疫苗是目前制備工藝成熟、使用廣泛、安全有效的疫苗，它以病原為基本物質(zhì)，與滅活劑充分作用后加入佐劑制成，一方面因病原抗原表位的存在可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體達(dá)到清除病原的目的，另一方面因病原的核酸與蛋白完全失活保證了使用與環(huán)境的安全，所以被廣泛應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防。在病原確定的情況下，滅活疫苗制備的關(guān)鍵步驟是滅活，只有完全滅活的安全疫苗才能進(jìn)行應(yīng)用，所以需要對(duì)病原滅活的程度進(jìn)行檢驗(yàn)?，F(xiàn)行滅活程度的檢驗(yàn)一般通過(guò)接種對(duì)本毒敏感的細(xì)胞、禽胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，根據(jù)病變或死亡狀況進(jìn)行判定，需花費(fèi)多達(dá)5-6天的時(shí)間，耗時(shí)長(zhǎng)且中間過(guò)程要求嚴(yán)格。傳統(tǒng)的方法在科技創(chuàng)新和生產(chǎn)效率提升的背景下已不合時(shí)宜，因此研發(fā)一種全新高效的檢測(cè)滅活疫苗滅活程度的方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種滅活疫苗滅活程度的檢測(cè)方法，該方法是在全面深入分析疫苗滅活過(guò)程和機(jī)理的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性的提出利用有害因素、遵循變害為利的原則，利用蛋白的空間表位在滅活過(guò)程和免疫檢測(cè)中的特性，集成滅活原理、空間表位特征與篩選方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法而建立的，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法耗時(shí)短且安全性、檢測(cè)精度及靈敏度高。
[0004]本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案為:
本發(fā)明提供了一種滅活疫苗滅活程度的檢測(cè)方法，該方法是以滅活中間產(chǎn)品所含空間表位的滅活作為疫苗滅活完全的標(biāo)志。
[0005]進(jìn)一步的，中間產(chǎn)品經(jīng)甲醛滅活后，以滅活中間產(chǎn)品所含空間表位為目的蛋白，將此目的蛋白作為夾心ELISA法的檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性表明滅活不完全，陰性則表明滅活完全。
[0006]進(jìn)一步的,所述病原蛋白空間表位的確定方法有肽掃描、氨基酸突變、X-ray、質(zhì)譜、噬菌體展示，其他病原蛋白空間表位方法均可以應(yīng)用于本發(fā)明的技術(shù)方案中。
[0007]所述夾心ELISA法包括以下步驟:
(1)將特異性抗體包被固相載體ELISA板，孵育后洗滌除去未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)，加入待檢樣品抗原，孵育一定時(shí)間，使抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物；
(2)洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)，隨后加入酶標(biāo)的特異性抗體，孵育使形成固相抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物，洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)抗體；
(3)最后加入顯色底物進(jìn)行顯色，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定0D450的值，結(jié)合陰陽(yáng)性對(duì)照，最終確定待檢樣品的滅活程度。
[0008]本發(fā)明是對(duì)分子生物學(xué)領(lǐng)域蛋白質(zhì)分析和制備、免疫學(xué)領(lǐng)域抗原分析和診斷的聯(lián)合應(yīng)用。甲醛滅活病毒時(shí)首先作用于核酸，與腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的堿基結(jié)合而使病毒核酸變性。當(dāng)甲醛濃度較高且作用時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，可與病毒蛋白質(zhì)的胺基結(jié)合，形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物，而后再與酰胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，致使病毒蛋白質(zhì)變性，并阻止病毒核酸的逸出。所以，甲醛必須作用足夠長(zhǎng)的時(shí)間，才能保證病毒的核酸和蛋白發(fā)生變性。據(jù)此可知，蛋白變性發(fā)生在核酸變性之后，可以作為滅活完全的判定標(biāo)準(zhǔn)。
[0009]蛋白由氨基酸組成，其中能夠激活免疫系統(tǒng)的氨基酸稱為抗原表位(抗原決定簇)，它是抗原分子中能與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合的特殊化學(xué)基團(tuán)，是引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)免疫應(yīng)答過(guò)程中受體細(xì)胞的不同分為B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位兩大類，其中B細(xì)胞表位是疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的有效部位，依據(jù)形態(tài)又可分為線性表位和構(gòu)象表位。線性表位由連續(xù)的氨基酸序列組成，構(gòu)象表位則是不連續(xù)的氨基酸序列，它存在于抗原分子三維結(jié)構(gòu)表面，是B細(xì)胞主要的表位。
[0010]空間表位因其構(gòu)象和存在的位置，能夠比線性表位更好地被免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生特異性抗體。但滅活劑使氨基酸發(fā)生交聯(lián)而變性，空間表位隨之被破壞，形成線性表位的狀態(tài)或者失去蛋白活性，而線性表位因本身長(zhǎng)度較短的線性狀態(tài)則基本不受影響，所以空間表位存在與否與蛋白是否變性是一致的，能夠作為滅活完全的判定標(biāo)準(zhǔn)。雖然滅活劑的作用對(duì)于疫苗來(lái)說(shuō)是具有破壞性作用的，但我們可以以變害為利為原則，將滅活過(guò)程中有害部分抽提出來(lái)，利用空間表位的被破壞建立新的檢驗(yàn)滅活疫苗滅活是否完全的方法。最后利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度和準(zhǔn)確度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肉眼觀察細(xì)胞、禽胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生的病變，可與PCR方法相當(dāng)，也避免了因病毒不同生長(zhǎng)特性而導(dǎo)致CPE或病變延遲出現(xiàn)的問(wèn)題。
[0011]本發(fā)明創(chuàng)新性的抽提出有害因素，遵循創(chuàng)新方法變害為利的原則，集成疫苗生產(chǎn)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域的成熟技術(shù)，建立全新高效的檢驗(yàn)滅活疫苗滅活程度的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果為:
1.提高了檢測(cè)精度和準(zhǔn)確度，變定性檢測(cè)為定量檢測(cè)。
[0012]2.縮短了檢測(cè)時(shí)間，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程最多只需24小時(shí)。同時(shí)需要的目的蛋白和抗體能夠?qū)崿F(xiàn)大量制備，一次制備可供多次使用。
[0013]3.提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，利用免疫學(xué)技術(shù)糾正肉眼不易觀察的病變。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)具體實(shí)施例和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0015]本發(fā)明中所用的生物、化學(xué)試劑均為常規(guī)市售，實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法，如未特別指出，則為按照分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所述的條件或者按照制造廠商提供的條件進(jìn)行。
[0016]實(shí)施例1 Lasota株滅活疫苗滅活程度的檢測(cè)
在生產(chǎn)中以雞胚接種尿囊腔的方式進(jìn)行病毒的擴(kuò)增，隨后收集尿囊液以甲醛為滅活劑進(jìn)行滅活。利用肽掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)，新城疫HN蛋白是病毒的主要抗原蛋白，163-569殘基包含的7個(gè)抗原表位均為空間表位，在免疫識(shí)別中起重要作用。所以以HN蛋白或某個(gè)空間表位為目的蛋白，昆蟲(chóng)細(xì)胞一桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為表達(dá)媒介進(jìn)行蛋白的表達(dá)，獲得具有天然構(gòu)象的NDV HN蛋白或包含163-569位氨基酸范圍內(nèi)空間表位的蛋白。將蛋白純化后免疫小鼠三次，每次間隔2周，最后一次免疫I周后采取全血，分離收集血清制備多克隆抗體。或者在獲