一株具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株篩選得到的具有低e-半乳糖酶活性的保加利亞乳桿菌菌株，以 及該菌株在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)酵乳制品中的益生菌不僅可以改善食品的品質(zhì)，其自身也為人體提供改善腸道 功能、促進(jìn)物質(zhì)吸收等有益作用。酸奶是最為普遍的一種利用乳酸菌發(fā)酵的乳制品，其主要 以德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑，在42°C下發(fā)酵至PH4. 5,低溫下儲存， 運輸和銷售。在發(fā)酵后和食用前的過程中，乳酸菌仍能繼續(xù)繁殖和發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，使pH 值進(jìn)一步下降，產(chǎn)生人們無法接受的過酸味，同時因為酸度過高使菌體大量死亡，活菌數(shù)目 較少，降低益生作用，這就是后酸化。
[0003] 要控制酸奶的后酸化，關(guān)鍵在于既要保持酸奶中乳酸菌的活性，又要降低乳酸菌 在低溫貯存過程中的產(chǎn)酸能力。目前國內(nèi)外對于控制酸奶后酸化的研宄有很多，主要如下： (1)發(fā)酵后快速冷卻和低溫貯藏，這兩種方法已得到廣泛的認(rèn)同，一定程度上解決了工廠實 際生產(chǎn)中酸奶的后酸化問題，其中發(fā)酵后快速冷卻是為了使菌株的生長受到抑制，活力迅 速下降，產(chǎn)酸降低，從而減緩酸奶后酸化，低溫貯藏也是同樣的道理，這是保證酸奶弱后酸 化的關(guān)鍵因素之一；（2)采用超高溫殺菌和巴氏殺菌等技術(shù)，發(fā)酵成熟的酸奶，對成品進(jìn)行 熱處理，但殺菌后的酸奶因不含有活菌，而不符合國際乳品聯(lián)合會（IDF)制定的發(fā)酵乳制 品中需含106cfu?ml/1活菌數(shù)的要求，同時《中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》乳酸飲料中也規(guī) 定：乳酸菌發(fā)酵制成的酸奶飲料中，活菌數(shù)量應(yīng)達(dá)到10 5106cfu 這樣的乳酸菌制品才 對人體具有生理保健功能，所以我們幾乎并不采用此方法控制酸奶制品的后酸化；(3)調(diào) 整發(fā)酵劑中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的比例，適當(dāng)加大酸奶發(fā)酵劑中球菌對桿菌的比 例可在一定程度上延長酸奶的保質(zhì)期。酸奶在發(fā)酵前期，嗜熱鏈球菌快速生長，當(dāng)pH值下 降到5. 5左右時，保加利亞乳桿菌生長加速，嗜熱鏈球菌的生長減緩，當(dāng)pH值下降到5. 0左 右時，此時保加利亞乳桿菌成為了酸奶發(fā)酵的主要菌株，當(dāng)pH值降至4. 6左右時，由于酪 蛋白的凝聚，此時凝乳開始形成，接著轉(zhuǎn)入低溫貯藏，此后主要都是保加利亞乳桿菌代謝乳 糖產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH值繼續(xù)降低，直至降到3. 5左右，pH的降低增加了菌體細(xì)胞膜的通透性，影 響了菌體內(nèi)的pH，從而抑制了乳糖酶的活性，在介質(zhì)pH為4. 0-4. 5時，其細(xì)胞內(nèi)的pH還能 維持在近中性附近，代謝酶的活力不受到影響，當(dāng)介質(zhì)的pH降至3. 5時，菌體細(xì)胞內(nèi)的新陳 代謝才受到抑制。Torriani等調(diào)整了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例，認(rèn)為當(dāng)桿菌和 球菌的比例為1 :1. 5時為最優(yōu)的發(fā)酵條件，可很好的延長酸奶的保質(zhì)期；(4)篩選低溫下 產(chǎn)酸弱的野生菌株，控制酸乳后酸化的最好方法是選育性狀優(yōu)良的保加利亞乳桿菌作為發(fā) 酵劑菌株，為了克服酸奶在貯存期間的后酸化問題，Mollet和他的雀巢團(tuán)隊分離并堅定了 由IS調(diào)控的0 -半乳糖苷酶缺陷型菌株，其在乳環(huán)境中不能正常代謝乳糖產(chǎn)生乳酸，從而 有效的降低酸奶后酸化，而Ongol也認(rèn)為自然環(huán)境中存在天然的H+-ATPase缺陷型的保加 利亞乳桿菌，一旦篩選出這種自發(fā)突變菌株，就可以從根本上解決酸奶的后酸化問題，這樣 的菌株性狀穩(wěn)定，操作上簡單，而且大大節(jié)省成本，對于降低酸乳后酸化意義重大；（5)篩 選0 _半乳糖苷酶活性弱的菌株，由于酸奶的后酸化主要是由于保加利亞乳桿菌在低溫貯 存下繼續(xù)發(fā)酵乳糖導(dǎo)致酸度增加造成的，因此我們可以通過減弱保加利亞乳桿菌對乳糖的 代謝強(qiáng)度來降低酸奶的后酸化。例如有學(xué)者通過誘變半乳糖苷酶基因，使該酶在40°C 發(fā)酵時具有較強(qiáng)活性，但在貯藏期活性減弱甚至失去活性；也有學(xué)者通過令0 _半乳糖苷 酶基因缺失和靈氣下游基因缺失或?qū)幋a0 _半乳糖苷酶基因序列進(jìn)行無意義突變的方 法篩選弱后酸化突變菌株；(6)篩選H+-ATPase活性弱的菌株，國內(nèi)一度熱衷于運用人工誘 變育種技術(shù)生產(chǎn)高溫下正常產(chǎn)酸，低溫產(chǎn)酸能力受抑制的菌株作發(fā)酵劑，如車?yán)桢i分別利 用紫外誘變和化學(xué)試劑（〇.9mg/mL的亞硝基胍）對保加利亞乳桿菌進(jìn)行誘變處理，并通過 青霉素濃縮處理，篩選出的突變株在12°C貯存過程中明顯的推遲了后酸化，但目前不能確 定這個突變株是否為H+-ATPase缺陷型菌株；(7)添加外來物質(zhì)控制酸奶后酸化，有學(xué)者將 羧甲基纖維素（CMC)和不同穩(wěn)定劑添加到酸奶制品中來提高酸奶的穩(wěn)定性，使酸奶的保質(zhì) 期延長l〇d以上，也有學(xué)者通過改變?nèi)樗峋鷮嶋H所能利用的水分量，來限制菌株的產(chǎn)酸和 生長能力，我們都知道為了保證酸奶的甜度，在鮮奶發(fā)酵前期，通常要加入少量的蔗糖、葡 萄糖，由于添加了外來物質(zhì)，使乳酸菌所能利用的水分活度值發(fā)生了改變，同時水分活度值 的變化也影響著球菌和桿菌的比例，從而進(jìn)一步降低酸奶的后酸化；(8)改變細(xì)胞膜的通 透性，研宄發(fā)現(xiàn)，變形鏈球菌在低pH環(huán)境中生存時，細(xì)胞膜中的單不飽和脂肪酸和長鏈脂 肪酸會增多，這樣降低細(xì)胞膜對質(zhì)子的通透性，從而抑制質(zhì)子進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)耐酸性，介質(zhì) 的pH值對乳酸菌細(xì)胞的新陳代謝有間接影響，菌株細(xì)胞質(zhì)的pH值對新陳代謝活動有直接 影響，在酸奶發(fā)酵過程中由于周圍介質(zhì)的pH值不斷下降，菌株的細(xì)胞膜受到侵害，通透性 改變影響了菌體介質(zhì)酸堿度，抑制了菌株的正常代謝，發(fā)酵成熟的酸奶，通過改變?nèi)樗峋?xì) 胞膜通透性，使胞外的抑制物質(zhì)滲透到菌體內(nèi)，抑制了乳酸菌的正常生長，從而降低了后酸 化的程度；(9)添加細(xì)菌素來控制酸奶后酸化，近年來，將乳酸鏈球菌素、丙酸桿菌所產(chǎn)的 丙酸桿菌素、短桿菌分泌的短桿菌素應(yīng)用到酸奶制作中，成功地抑制了酸奶的后酸化，其中 詹氏桿菌素，是一種熱穩(wěn)定的丙酸菌屬的細(xì)菌素，在生產(chǎn)過程中與保加利亞乳桿菌和嗜熱 鏈球菌同時添加，可抑制這兩種菌的生長和產(chǎn)酸，尤其是保加利亞乳桿菌，十分敏感，添加 了詹氏桿菌素的酸奶可以在5°C貯存30d的情況下pH仍維持在4. 15-4. 42之間。
[0004] 雖然眾多研宄者對控制酸奶后酸化的方法進(jìn)行深入地探討，但這些方法中多多少 少存在一些弊端：如添加防腐劑和穩(wěn)定劑雖在一定程度上防止微生物污染，改善了酸奶的 組織狀態(tài)，但并沒有解決酸奶酸味過重的問題，造成了生產(chǎn)成本增加；還有一點就是Nisin 在食品中特別在固體食品中分散性不好，且是在加工后期加入，易帶來污染；誘變育種菌和 基因工程菌的表達(dá)專一性和穩(wěn)定性還存在隱患。
[0005]Benedi等人經(jīng)過研宄發(fā)現(xiàn)，乳酸菌分解乳糖代謝為半乳糖和葡萄糖這一步驟是整 個乳糖代謝的限速步驟，而0 _半乳糖苷酶是酸奶在發(fā)酵結(jié)束后貯存過程中引起后酸化的 關(guān)鍵酶，當(dāng)0 _半乳糖苷酶催化產(chǎn)生的乳酸還不足以抑制其活性時，保加利亞乳桿菌會繼 續(xù)代謝乳糖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致酸奶發(fā)生后酸化。為了解決酸奶后酸化問題，人們曾嘗試改善生 產(chǎn)工藝和儲藏等方法，或通過基因誘變得到后酸化能力弱的突變株，但都存在著一定的弊 端且無法根本解決這一問題。目前，通過改變保加利亞乳桿菌半乳糖苷酶的活性來控 制發(fā)酵酸乳后酸化的研宄已經(jīng)有很多，比如令編碼e-半乳糖苷酶的基因缺失或是將編碼 0 -半乳糖苷酶的基因突變，或是擾亂乳糖操作子的編碼序列，從而改變野生菌株中0 -半 乳糖苷酶活性，一定程度上減緩了后酸化水平，可見改變菌株的0 -半乳糖苷酶活性可有 效降低酸奶后酸化水平。目前通過改善工藝水平控制后酸化的方法很多，但都不能從根本 上解決問題，而誘變育種及基因工程的遺傳穩(wěn)定性受到多因素影響和制約，Ongol等人提出 在自然界中可能存在一些自發(fā)的缺陷型菌株，應(yīng)用這種菌株生產(chǎn)弱后酸化酸奶可以成為一 種新途徑。本發(fā)明的主要目的是篩選出天然的弱后酸化保加利亞乳桿菌，使其低溫產(chǎn)酸 慢，高溫產(chǎn)酸快，從而開發(fā)出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的低成本的弱后酸化酸奶發(fā)酵劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決保加利亞乳桿菌在酸奶儲存期間引起的后酸化問題，本發(fā)明通過對來自 傳統(tǒng)乳制品中分離出的保加利亞乳桿菌進(jìn)行篩選，得到1株具有低半乳糖酶活性的菌 株，該菌株在脫脂乳中具有較弱的產(chǎn)酸能力，穩(wěn)定性強(qiáng)，生產(chǎn)成本低，有效延緩貨架期，可作 為弱后酸化酸奶發(fā)酵劑使用。
[0007] 本發(fā)明的一種具有低半乳糖酶活性的保加利亞乳桿菌菌株，命名為 KLDS1002,分類命名為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)，該菌株是從傳統(tǒng)乳制品中分離的保加利亞乳桿菌中篩選出的，于2014年11 月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，微生物保藏號為CGMCC No. 9957,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所。
[0008] 本發(fā)明的菌株是以e-半乳糖酶活性為篩選指標(biāo)進(jìn)行初篩，再根據(jù)其生長性能和 發(fā)酵特性得到的一株后酸化能力弱，發(fā)酵性能優(yōu)良的保加利亞乳桿菌。本發(fā)明菌株性能較 為穩(wěn)定，不會像突變菌株一樣因傳代次數(shù)過多導(dǎo)致不穩(wěn)定，并且其所具有的弱后酸化能力 也可一直保持。同時本發(fā)明菌株由于半乳糖酶活性較低，乳糖分解速度減慢，葡萄糖分 解為丙酮酸時產(chǎn)生ATP的速度也變慢，導(dǎo)致提供給H+-ATPase的能量也相應(yīng)較少，從而降低 了菌株細(xì)胞的代謝活性，減少向胞外排出的質(zhì)子，減緩了酸奶后酸化發(fā)生。
[0009] 本發(fā)明菌株KLDS1002的16SrDNA序列與目前發(fā)表的德氏乳桿菌保加利亞亞種的 16SrDNA，同源性達(dá)到95%以上。綜合形態(tài)特征與16SrDNA序列鑒定，菌株KLDS1002為德氏 乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)。
[0010] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述菌株的e-半乳糖酶活性與產(chǎn)酸能力呈正相關(guān)。
[0011] 本發(fā)明還公開了上述具有低e-半乳糖酶活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種在制 備發(fā)酵乳和發(fā)酵食品中的應(yīng)用。
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述發(fā)酵食品為酸奶。
[0013] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述菌株在42°C發(fā)酵12h時，酸奶pH值從6.36降至4. 53， 下降幅度明顯低于對照菌，具有弱后酸化作用。
[0014] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，其特征在于：所述菌株在42°C發(fā)酵后，在4°C冷藏21d期間， pH值的變化范圍在4. 55-4. 25。
[0015] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述菌株在42°C發(fā)酵后，在4°C冷藏21d期間，pH值下降了 0. 3pH單位。