專利名稱：用于先天性代謝異常的檢測方法和檢測設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠簡單而迅速地測定生物樣品中含有的D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸而不需要進(jìn)行煩瑣的預(yù)處理的測定方法和測定設(shè)備。
特別在半乳糖血癥、槭糖尿病和苯丙酮酸尿癥這三種屬于先天性代謝異常的疾病中，該方法和設(shè)備是可以用于對(duì)新生兒篩查以進(jìn)行這些疾病的早期檢測、患有這些疾病的患者的床邊檢查和監(jiān)測其每日生活情況。
先天性代謝異常成為篩查的靶向疾病的主要原因在于闡明了醫(yī)學(xué)上的優(yōu)點(diǎn)，使得可以希望通過早期檢測可以使患有所述疾病的兒童正常發(fā)育且由此獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。一方面，存在拖延檢測產(chǎn)生有生理缺陷的兒童、建立用于他們的調(diào)節(jié)中心或研究機(jī)構(gòu)和為護(hù)理這些患病兒童付出巨額醫(yī)療開支的情況。另一方面，又存在早期檢測和治療會(huì)使受傷害的兒童發(fā)育成健康成年人的情況。比較顯示后一種情況具有極高的經(jīng)濟(jì)效益且改善了患病兒童的QOL。
因此，在不同國家均將預(yù)防因代謝失調(diào)導(dǎo)致的智力低下和發(fā)育受損看作是對(duì)公眾健康領(lǐng)域中存在的挑戰(zhàn)且用于新生兒篩查的方案應(yīng)得到國家和政府的支持。
代表先天性代謝異常的PKU是因先天缺乏將必需氨基酸L-Phe轉(zhuǎn)化成酪氨酸的L-Phe羥化酶而導(dǎo)致的疾病。在這種疾病中，L-Phe在體內(nèi)累積且大量苯基丙酮酸和L-Phe在尿中排泄。臨床癥狀包括智力障礙，如智能缺陷、神經(jīng)病和黑素缺失癥。為了治療該病，需要限制L-Phe攝取的膳食療法，而這種治療方法必須至少持續(xù)達(dá)成人期且優(yōu)選持續(xù)整個(gè)生命過程。由于L-Phe是人體所必需的氨基酸之一，所以必須將其攝取維持在不會(huì)導(dǎo)致腦病的最大量與身體生長必不可少的最小量之間。
母源PKU是患有PKU的婦女如果妊娠，懷有患發(fā)育障礙、智力障礙、小頭或心臟畸形的胎兒的情況，這是因?yàn)樗齻兙哂懈叩难狶-Phe水平。然而，這些異常情況可以通過自妊娠前控制血液L-Phe水平來預(yù)防。
診斷用篩查檢測方法包括由Guthrie等(Pediatrics，Vol.32，p.338(1963))開發(fā)的細(xì)菌抑制測定法(BIA)。BIA在已經(jīng)通過穿刺取自新生兒足跟并使之滲漏入濾紙的血樣上使用枯草芽孢桿菌和代謝拮抗劑。篩查開始于應(yīng)用BIA。此外，Guthrie還發(fā)現(xiàn)可以使用BIA的機(jī)理測定L-組氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸(L-Leu)且可以使用大腸桿菌檢測D-半乳糖(D-Gal)。因此，也開始了對(duì)組氨酸血癥、高胱氨酸尿癥、槭糖尿病(MSUD)和半乳糖血癥(GE)的篩查。
通過BIA法或應(yīng)用大腸桿菌和噬菌體的Paigen法(Journal of Lab.Clin.Med.，Vol.99，p.895(1982))在上個(gè)世紀(jì)60年代建立了用于目前多重篩查系統(tǒng)的機(jī)理。這些檢測方法是極為簡單的方法，它們應(yīng)用濾紙上的干燥血點(diǎn)作為樣品且其中將被打孔器穿孔的血浸漬的濾紙圓片放置在瓊脂培養(yǎng)基上并保溫過夜，此后評(píng)價(jià)細(xì)菌生長環(huán)的大小。這些方法不需要昂貴的儀器、就試劑成本而言也令人滿意且能夠?qū)Υ罅繕悠窓z測多個(gè)項(xiàng)目。
然而，最終檢測結(jié)果通過基于肉眼觀察的評(píng)價(jià)而獲得，由此導(dǎo)致難以確保評(píng)價(jià)結(jié)果的客觀性并保存評(píng)價(jià)結(jié)果的記錄。對(duì)這種困難的改進(jìn)實(shí)例是使用照相機(jī)成象(Journal of the Japan Society of MassScreening，Vol.6，p.23(1996))，該方法要求對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行定量和記錄。不過，對(duì)帶有很大變化的細(xì)菌生長進(jìn)行定量是極其困難的且便利性最低。
另一方面，也可以應(yīng)用高效液相層析法(Journal ofChromatography，vol.274，p.318(1983)；Journal of the Japan Societyof Mass Screening，Vol.5，p.86(1995))和自動(dòng)分析儀(ClinicalChemistry，Vol.30，p.287(1984))，但困難在于靶向疾病僅為氨基酸代謝異常、使用昂貴的測定裝置且便利性和快捷性也不可靠。
近來已經(jīng)開發(fā)了基于稱作酶法(Screening，Vol.1，p.63(1992)；The Journal of Medicine and Pharmaceutical Science，Vol.31，p.1237(1994))或微量培養(yǎng)板熒光法(Clinical Chemistry，Vol.35，p.1962(1989))的方法的試劑盒，其中在微量培養(yǎng)板上首先進(jìn)行酶反應(yīng)、隨后進(jìn)行熒光反應(yīng)并根據(jù)熒光強(qiáng)度確定樣品中的D-Gal、包括L-Leu在內(nèi)的支鏈氨基酸以及L-Phe和L-甲硫氨酸(The Journal of Medicineand Pharmaceutical Science，Vol.31，p.1211(1997))。該試劑盒具有較高的處理樣品的能力且已經(jīng)獲得了確保對(duì)檢測結(jié)果的客觀性評(píng)價(jià)的記錄和定量，這是通過常規(guī)方法難以獲得的優(yōu)點(diǎn)。此外，該試劑盒可以在約3小時(shí)內(nèi)獲得檢測結(jié)果，從而表現(xiàn)出在快捷性方面的顯著改善。
如上所述，處理新生兒篩查過程中大量樣品的方法得到建立。然而，如果將患糖尿病的患者中進(jìn)行血糖監(jiān)測的典型的護(hù)理點(diǎn)檢測(POCT)看作實(shí)例，那么其便利性和快捷性在很多方面還有待改善。
在POCT方法中，已經(jīng)使用簡單、快捷、小型的儀器實(shí)現(xiàn)了急癥檢查和床邊實(shí)時(shí)監(jiān)測作為醫(yī)療和護(hù)理安排中的臨床檢測。目前，可以將幾毫升全血用作血糖測定樣品且在30秒-1分鐘內(nèi)就可以得到檢測結(jié)果(例如WO99/51974(1999))。該測定方法是依賴于下列反應(yīng)的方法酶反應(yīng)、隨后是電化學(xué)反應(yīng)(例如，Analytical Chemistry，Vol.56，p.667(1984))；或酶反應(yīng)、隨后是顯色反應(yīng)(例如，The Journalof Medicine and Pharmaceutical Science，Vol.39，p.357(1998))。每種方法均包括一個(gè)簡單的步驟，其中將含有試劑的試紙固定在小型測定儀上并給該試紙點(diǎn)樣或?qū)悠返卧谠嚰埳锨覍⒃撛嚰埞潭ㄔ跍y定儀上。
特別對(duì)先天性代謝異常而言，早期檢測和早期治療是最有效的方法。在它們中，GE和MSUD是極其緊迫的疾病且預(yù)計(jì)它們控制患病兒童的預(yù)后的情況。
因此，顯然如果建立了在血液取樣點(diǎn)上獲得檢測結(jié)果的新型檢測系統(tǒng)，那么就可以確保滿足大量需求。
同樣也需要建立用于PKU和母源PKU檢測的自我測定方法。
所述的生物樣品并不限于全血、血清、血漿和血液，而還可以將屬于各種變化形式的體液、如尿和唾液用作樣品。不僅可以測定生物樣品，而且還可以測定食物中如D-Gal和L-Leu這樣的支鏈氨基酸以及L-Phe。
本發(fā)明的測定機(jī)理是應(yīng)用使用對(duì)作為底物的D-Gal、包括L-Leu在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-Phe中的每一種均具有特異性的脫氫酶以及輔酶的酶反應(yīng)和隨后電子介體與四唑鹽之間的氧化還原反應(yīng)并檢測依賴于所述底物濃度且化學(xué)上穩(wěn)定的終產(chǎn)物甲。該檢測方法充分利用了這種稱作在甲形成中發(fā)生的顯色反應(yīng)的方法和甲形成過程中因電子給予和接受所產(chǎn)生的氧化還原反應(yīng)的特征且利用了光學(xué)技術(shù)和/或電化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。
此外，本發(fā)明的檢測方法包括預(yù)先固定對(duì)測定而言必不可少的反應(yīng)試劑，由此避免了對(duì)應(yīng)用時(shí)制備試劑的需求且最大限度地簡化了檢驗(yàn)員的操作。
此外，本發(fā)明的檢測系統(tǒng)包括使用上述檢測方法且能夠固定有反應(yīng)試劑的試紙(傳感器芯片)和帶有光學(xué)檢測電路和電化學(xué)檢測電路的小型化測定裝置(袖珍計(jì)數(shù)器)。將所述試紙固定在測定儀上并將屬于生物樣品的樣品滴在各試紙上。僅通過該步驟在幾分鐘內(nèi)完成檢測并顯示檢測結(jié)果。
按照這種方式獲得了能夠在取生物樣品的斑點(diǎn)上進(jìn)行檢測并通過簡單步驟得到檢測結(jié)果的檢測系統(tǒng)。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了檢測方法和檢測設(shè)備，它們使用分別為GE、MSUD和PKU這三種先天性代謝異常中的生物樣品內(nèi)檢測靶物的D-Gal、包括L-Leu在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-Phe作為底物；該檢測方法和檢測設(shè)備至少使用對(duì)所述靶物具有特異性的脫氫酶、輔酶、電子介體和四唑鹽作為反應(yīng)試劑；且該檢測方法和檢測設(shè)備通過應(yīng)用光學(xué)檢測和/或電化學(xué)檢測將依賴于所述底物濃度的終產(chǎn)物甲計(jì)算為底物濃度。
用于本發(fā)明中三種疾病的便利而快捷的檢測方法的特征在于預(yù)先將反應(yīng)試劑固定在例如比色杯、管、孔或片盒這樣的反應(yīng)位置上并將生物樣本、樣品滴在該反應(yīng)位置上，由此溶解并混合所固定的試劑以便進(jìn)行與酶的反應(yīng)和隨后的氧化還原反應(yīng)。然后通過使用光學(xué)檢測和/或電化學(xué)檢測來測定終產(chǎn)物甲。
用于本發(fā)明三種疾病的檢測設(shè)備包括固定有反應(yīng)試劑的使用上述檢測方法生產(chǎn)的試紙(傳感器芯片)和帶有光學(xué)檢測電路和電化學(xué)檢測電路的簡易小型化測定裝置(袖珍計(jì)數(shù)器)。
固定有反應(yīng)試劑的試紙的特征在于當(dāng)?shù)渭訕悠窌r(shí)具有快速吸收能力并提高所固定反應(yīng)試劑溶解性的結(jié)構(gòu)。將該試紙?jiān)O(shè)計(jì)成使樣品從上到下進(jìn)行展開且該試紙具有層狀結(jié)構(gòu)。在該試紙中配有吸收層、展開層和反應(yīng)層并選擇適合于相應(yīng)用途的材料。由于具有這種層狀結(jié)構(gòu)，所以產(chǎn)生的試紙?jiān)诜蛛x樣品的能力方面令人滿意。就全血而言，看起來為血細(xì)胞的有色成分沒有在最下層中出現(xiàn)。
在小型化測定裝置中的光學(xué)檢測電路使得測定作為指示劑的甲的吸光度成為可能(日本未審專利公開號(hào)1997-286784(1997)；Analyst，Vol.120，p.113(1995))。在本發(fā)明中新近設(shè)計(jì)出了這種裝置的結(jié)構(gòu)。具體地說，該裝置由用于發(fā)射甲的特定吸收波長的光源和在甲接觸來自該光源的入射光后接受反射光的元件組成，且該裝置測定了與甲濃度成反比的反射光的量。將發(fā)光二極管或激光二極管用作光源，而將光二極管或光敏晶體管用作光檢測器，由此所述的光學(xué)檢測電路可以由相對(duì)低廉的半導(dǎo)體器件構(gòu)成。
而電化學(xué)檢測電路將對(duì)甲特異的氧化電位施加在電極系統(tǒng)上，并測定此時(shí)出現(xiàn)的電解氧化電流。其結(jié)構(gòu)由施加恒電位的電路和測定感應(yīng)電流的電路組成。還可使用半導(dǎo)體器件以低成本使這種檢測電路小型化。
通過擁有光學(xué)檢測方法和電化學(xué)檢測方法這兩種類型的檢測方法，可以利用這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)。如果在樣品中包含大量氧化還原物質(zhì)，即污染物，那么電化學(xué)背景響應(yīng)就會(huì)增強(qiáng)且這種應(yīng)發(fā)現(xiàn)的響應(yīng)是干擾。在這類情況中，光學(xué)檢測方法是合適的。另一方面，就深色或明顯的濁度而言，電化學(xué)檢測方法是有利的。本發(fā)明中的檢測方法的顯著特征在于采用了上述兩種方法來補(bǔ)償測定方法中的缺陷，由此可以顯著改善測定方法和檢測結(jié)果的可靠性。
形成固定有反應(yīng)試劑的試紙的基本結(jié)構(gòu)的電極系統(tǒng)應(yīng)用了已經(jīng)由我們發(fā)明的反應(yīng)機(jī)理和制造技術(shù)(日本未審專利公開號(hào)2000-35413(2000)、WO00/04378(2000)、PCT/JP99/01392(1999))。該電極系統(tǒng)至少包括使用導(dǎo)電材料制成的工作電極和對(duì)電極。使內(nèi)部固定有所述反應(yīng)試劑的層狀結(jié)構(gòu)排列在電極反應(yīng)部分的上表面。
使用本發(fā)明用于先天性代謝異常的檢測方法和檢測設(shè)備獲得的優(yōu)點(diǎn)如下所述由于預(yù)先固定了反應(yīng)試劑，所以對(duì)檢驗(yàn)員而言不需要制備試劑。不需要進(jìn)行預(yù)處理。由于使用了固定有反應(yīng)試劑的試紙和測定裝置，所以不需要昂貴的設(shè)備。任何人可以實(shí)施該步驟而并非需要本領(lǐng)域技術(shù)人員來進(jìn)行，這是因?yàn)橥ㄟ^簡單地將試紙固定在所述測定裝置上并使樣品沉積在該試紙上，測定過程可以自動(dòng)開始且結(jié)果可以自動(dòng)顯示出來。
檢測方法和設(shè)備的具體應(yīng)用是在檢測系統(tǒng)中用于世界上已經(jīng)廣泛開展的新生兒篩查。通常檢測系統(tǒng)需要約1周的期限來取血樣、傳送諸如含有所取血樣的濾紙這樣的樣品、在篩查中心進(jìn)行檢測和報(bào)告檢測結(jié)果。本發(fā)明的檢測方法和設(shè)備取消了這種需要的期限并使檢測在取樣點(diǎn)上進(jìn)行。考慮到花費(fèi)在新廠房和設(shè)備以及維護(hù)和管理方面的勞動(dòng)力成本，可以預(yù)見到無限的經(jīng)濟(jì)效益。在某些國家，盡管無一不建立了用于新生兒的篩查系統(tǒng)，但是通過引入不需特定儀器或設(shè)備的本發(fā)明檢測系統(tǒng)可以立即開始檢測。
與新生兒篩查中目前的檢測儀器相比，本發(fā)明的檢測系統(tǒng)是極為小型化和低廉的，使得可以將其配屬在產(chǎn)科、婦科和兒科且可以進(jìn)一步用于在個(gè)人家庭應(yīng)用和簡易應(yīng)用。
就屬于需要緊急處理的疾病的GE和MSUD而言，可以迅速提供檢測結(jié)果，由此可以進(jìn)行即刻的適宜治療以便使患病兒童的預(yù)后達(dá)到最佳結(jié)果。
如上所述，測定裝置(袖珍計(jì)數(shù)器)和三種類型指定試紙(傳感器芯片)的組合提供了本發(fā)明的檢測系統(tǒng)作為可以廣泛開展的新生兒篩查的工具并作為便利而快捷地檢測患病兒童和患有先天性代謝異常的患者的工具。
將附圖
中的數(shù)字定義如下1.絕緣(透明)板；2.導(dǎo)線；3.絕緣層；4.工作電極；5.對(duì)電極；6.固定有反應(yīng)試劑的層；7.吸收層；8.展開層；9.反應(yīng)層；10.墊板；11.覆蓋板；12.樣品供應(yīng)門；13.樣品；14.光源；15.光學(xué)檢測窗；16.光檢測器；17.傳感器芯片；18.袖珍計(jì)數(shù)器；19.芯片插入門；20.液晶顯示器；21.開關(guān)；22.微型計(jì)算機(jī)；23.光源14和電位施加電路；24.光檢測器16和感應(yīng)電流測定電路；25.定時(shí)器；26.蜂鳴器；和27.電池。
優(yōu)選實(shí)施例的描述在本發(fā)明中，按順序描述涉及檢測方法的內(nèi)容和涉及檢測設(shè)備的內(nèi)容。首先在下面描述檢測方法中的反應(yīng)試劑。
對(duì)本發(fā)明中所用的脫氫酶不作限制，條件是它們是應(yīng)用D-Gal、包括L-Leu在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-Phe作為底物和進(jìn)一步形成還原輔酶的酶類。對(duì)它們的來源不作限定。
對(duì)電子介體不作限定，條件是它是與還原輔酶和四唑鹽迅速發(fā)生氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)。例如，可以使用醌類、心肌黃酶、細(xì)胞色素、紫精(viologens)、吩嗪類、吩噁嗪類、吩噻嗪類、高鐵氰化物、鐵氧還蛋白、二茂鐵及其衍生物。在這些化合物中，吩嗪類表現(xiàn)出反應(yīng)穩(wěn)定性。1-甲氧基PMS特別具有高度的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和與還原輔酶和四唑鹽的極佳反應(yīng)性且由此發(fā)現(xiàn)優(yōu)選將其用作本發(fā)明的電子介體。
對(duì)四唑鹽不作限定，條件是它形成甲。在它們中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺代苯基)-2H-四唑一鈉鹽(WST-1)優(yōu)選為本發(fā)明的四唑鹽。這是因?yàn)閃ST-1還原時(shí)形成的甲是水溶性的且化學(xué)上是穩(wěn)定的，而所得甲在本發(fā)明的光學(xué)和電化學(xué)檢測方法中表現(xiàn)出令人滿意的反應(yīng)。
由于預(yù)先固定了上述反應(yīng)試劑，所以能夠構(gòu)成一種方法，其中僅依賴于反應(yīng)試劑接觸生物樣品，溶解并混合以進(jìn)行一系列反應(yīng)，由此最終形成甲。通過將所述反應(yīng)試劑溶液涂敷在反應(yīng)位置上并干燥它們來完成本方法。固定后通過使它們避光并使它們干燥來改善其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
接下來如下描述涉及檢測設(shè)備的內(nèi)容。
本發(fā)明中所用的內(nèi)部固定有上述反應(yīng)試劑的層狀結(jié)構(gòu)的試紙(傳感器芯片)應(yīng)用了通過與生物樣品反應(yīng)而最終形成的甲、通過光學(xué)檢測方法和/或電化學(xué)檢測方法的組合來檢測。
對(duì)本發(fā)明電化學(xué)檢測中所用的電極系統(tǒng)沒有進(jìn)行限定，條件是它是導(dǎo)電材料且條件是它是電化學(xué)上穩(wěn)定的。該材料的實(shí)例是碳、金、銀、銀/氯化銀、鎳、鉑、鉑黑和鈀及其合金。在它們中，研究了不同的材料且發(fā)現(xiàn)碳材料是低廉且化學(xué)上穩(wěn)定的，而由此優(yōu)選將它作為本發(fā)明電極系統(tǒng)中的工作電極。
碳材料指的是作為整體的含碳材料。對(duì)可用的碳材料沒有限定，但它可以是常規(guī)碳電極中所用的任意材料。例如，可以使用碳纖維、碳黑、碳糊、玻璃化碳黑和石墨。
按照常用方式將這類碳材料制成絕緣板上的電極部分。將使用樹脂粘合劑等制成的碳材料糊網(wǎng)板印刷在所述板上并通過加熱來干燥，由此可以形成所述電極部分。
并非將印刷方法限定到網(wǎng)板印刷，而可以使用其它方法，如凹板印刷、膠印或噴墨印刷。
在電極系統(tǒng)是將對(duì)電極同時(shí)作為參比電極的兩電極系統(tǒng)的先決條件下，將銀/氯化銀選作對(duì)電極。此外，將具有最高導(dǎo)電性的銀選作電極反應(yīng)部分與電化學(xué)檢測電路之間的連接物導(dǎo)線。該導(dǎo)線通過網(wǎng)板印刷制成。
絕緣板的實(shí)例是玻璃、基于玻璃結(jié)構(gòu)的環(huán)氧樹脂、陶瓷和塑料。然而，對(duì)絕緣板沒有進(jìn)行限定，條件是它是在通過印刷或添加樣品時(shí)形成電極部分過程中不受影響的物質(zhì)。例如，低廉的塑料薄膜，如聚酯、聚乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET)、聚苯乙烯或聚丙烯的薄膜。此外，由于與導(dǎo)電油墨粘合和良好的加工性能，所以已經(jīng)發(fā)現(xiàn)優(yōu)選PET薄膜。
為了以比色方式測定光學(xué)檢測中甲的顯色反應(yīng)，必須將無色透明材料選作絕緣板且在測定波長處沒有吸收，和提供接觸來自光源的光的窗口是必不可少的。
對(duì)覆蓋板、墊片和粘合它們的材料沒有限定其形狀或類型，條件是它們不受屬于樣品的生物樣本的影響，它們支持固定有反應(yīng)試劑的層、它們不會(huì)影響一系列反應(yīng)且它們可以防止反應(yīng)部分與外部接觸。
固定有反應(yīng)試劑的層由吸收層、展開層和反應(yīng)層這三層組成且其材料分別是聚丙烯、硝化纖維和聚醚砜。固定有反應(yīng)試劑的層可以是單層結(jié)構(gòu)且對(duì)其表面沒有進(jìn)行限定，條件是該層不會(huì)使反應(yīng)試劑變質(zhì)、分離樣品的能力較高且對(duì)生物樣品具有高親和力。
如下描述用于使用傳感器芯片進(jìn)行檢測的小型簡易測定裝置(袖珍計(jì)數(shù)器)。
這種袖珍計(jì)數(shù)器可以與所述的傳感器芯片連接、帶有光學(xué)檢測電路和電化學(xué)檢測電路且起檢測甲濃度的作用、然后將其轉(zhuǎn)化成生物樣品中包含的各底物的濃度并顯示檢測結(jié)果。
光學(xué)檢測電路需要發(fā)射甲吸收波長的光源和用于反射光的光檢測器。
電化學(xué)檢測電路需要施加恒電位的電路和用于檢測感應(yīng)電流的電路。
開關(guān)用于電源和不同裝置。盡管附圖中描述了這種開關(guān)，但是如果采用自動(dòng)方式，并非必需采用該部件。
在形成電極系統(tǒng)的過程中，將導(dǎo)電銀粉油墨(Nippon Acheson)網(wǎng)板印刷在PET薄膜(TORAY INDUSTRIES)的絕緣板1上且然后通過加熱干燥(120℃，15分鐘)而形成導(dǎo)線2。然后使用絕緣油墨(Nippon Acheson)制成(通過紫外線照射固化)絕緣層3，該部分與工作電極4和保持在其下面的對(duì)電極5連接。使用導(dǎo)電石墨(NipponAcheson)網(wǎng)板印刷工作電極4并使用導(dǎo)電銀/氯化銀油墨(NipponAcheson)網(wǎng)板印刷對(duì)電極5。通過加熱(120℃，15分鐘)干燥工作電極4和對(duì)電極5。按照這種方式通過印刷層壓電極系統(tǒng)。
然后在反應(yīng)試劑固定層6中使用于調(diào)節(jié)酶反應(yīng)最佳pH的緩沖劑成分作為溶液被吸附層7的聚丙烯膜(Nippon Millipore)吸附并干燥(40℃，15分鐘)而用于固定。
將電子介體1-甲氧基PMS(Dojin Kagaku Kenkyujo)溶于超純水，然后通過展開層8的硝化纖維膜(Nippon Millipore)吸附并干燥(40℃，15分鐘)而用于固定。
將作為四唑鹽的WST-1(Dojin Kagaku Kenkyujo)、相應(yīng)于各底物的脫氫酶和作為輔酶的氧化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)(Oriental Yeast)溶于磷酸鹽緩沖液(pH7.4，20mM)、然后使之被反應(yīng)層9的聚醚砜膜(Nippon Pall)吸附并干燥(40℃，15分鐘)而用于固定。
放置內(nèi)部固定有所需反應(yīng)試劑的層狀結(jié)構(gòu)的反應(yīng)試劑固定層6，使其夾在通過印刷形成的電極上的墊板10之間。給這種復(fù)合體覆蓋覆蓋板11以便產(chǎn)生傳感器芯片17。實(shí)施例2傳感器芯片的基礎(chǔ)響應(yīng)按照實(shí)施例1中的制造步驟制備用于GE、MSUD和PKU檢測的專用傳感器芯片。僅改變對(duì)作為底物的D-Gal、包括L-Leu在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-Phe具有特異性的脫氫酶且所有其它反應(yīng)試劑均相同。
就GE檢測傳感器芯片而言，使用D-Gal脫氫酶(EC 1.1.1.48，Roche Diagnostics)。
可以通過共存的堿性磷酸酶(EC 3.1.3.1)來測定磷酸化Gal(半乳糖1-磷酸)和Gal。
就MSUD檢測傳感器芯片而言，使用L-Leu脫氫酶(EC 1.4.1.9，TOYOBO)。就PKU檢測傳感器芯片而言，使用L-Phe脫氫酶(EC1.4.1.20，UNITIKA)。
使用按不同濃度制備的相應(yīng)底物的標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得三種類型傳感器芯片的基礎(chǔ)相應(yīng)值。
通過使來自光源(ANDO ELECTRIC)的任意波長的可見光通過光學(xué)纖維定向于排列在絕緣板上的反應(yīng)試劑固定層的最下表面并測定反射光(ADVANTEST)的量來進(jìn)行光學(xué)檢測。在點(diǎn)樣后使點(diǎn)樣的芯片穩(wěn)定120秒作為酶反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)所需的時(shí)間。然后以比色方法測定甲的顯色反應(yīng)。
在甲的顯色反應(yīng)中，峰值吸收波長隨pH的不同而移動(dòng)。在本發(fā)明所用的pH范圍內(nèi)，在約450nm-600nm的波長范圍內(nèi)確認(rèn)有峰值吸收波長。
通過下列步驟來進(jìn)行電化學(xué)檢測點(diǎn)樣；然后按照與如上所述相同的方式使點(diǎn)樣的芯片穩(wěn)定120秒作為酶反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)所需的時(shí)間；施加+500mV作為甲的氧化電位，其中將對(duì)電極作為參比電極；并測定這種情況中產(chǎn)生的甲的氧化電流(Hokuto Denko)。
在達(dá)2mM的濃度范圍內(nèi)，兩種檢測方法和相應(yīng)的傳感器芯片均產(chǎn)生依賴于底物濃度的相應(yīng)值。實(shí)施例3簡易計(jì)數(shù)器的生產(chǎn)使用GE、MSUD和PKU檢測傳感器芯片的測定裝置簡易計(jì)數(shù)器如附圖4中所示，且如下解釋檢測過程。
將各傳感器芯片17通過芯片插入部分19安裝在簡易計(jì)數(shù)器18上。此時(shí)對(duì)計(jì)數(shù)器的啟動(dòng)不作限制；通過開關(guān)21啟動(dòng)計(jì)數(shù)器或可以自動(dòng)啟動(dòng)計(jì)數(shù)器。
將樣品13滴在傳感器芯片17上并開始進(jìn)行測定。也是在這種情況中，對(duì)是通過開關(guān)21還是自動(dòng)開始進(jìn)行測定不作限制。
使用定時(shí)器25使產(chǎn)生的酶反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)進(jìn)行一定的時(shí)間期限，此后進(jìn)行光學(xué)檢測和電化學(xué)檢測。
光學(xué)檢測方法包括使絕緣板1上反應(yīng)試劑固定層6的最下表面(光學(xué)檢測窗15)與來自光源的光接觸一定時(shí)間期限(相當(dāng)于附圖4中的23)并使用光檢測器測定反射光的量(相當(dāng)于附圖4的24)的步驟。
電化學(xué)檢測方法包括給傳感器芯片電極系統(tǒng)施加預(yù)定電位(相當(dāng)于附圖4的23)，并測定這種情況中產(chǎn)生的感應(yīng)電流的數(shù)值(相當(dāng)于附圖4的24)的步驟。
將所獲得的測定數(shù)值進(jìn)行不同轉(zhuǎn)化、如電流-電壓轉(zhuǎn)化和模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)化以便通過微型計(jì)算機(jī)22計(jì)算底物濃度。結(jié)果顯示在液晶顯示器20上。
此外，安裝蜂鳴器26以便改善可操作性并通過電池27驅(qū)動(dòng)計(jì)數(shù)器以便提高便攜性。
本發(fā)明的簡易計(jì)數(shù)器可自動(dòng)鑒定三種類型的專用芯片、完成一系列測定并顯示相應(yīng)結(jié)果。在檢測多個(gè)項(xiàng)目的過程中，可以使芯片插入部分排列在三個(gè)通道中以便允許幾乎同時(shí)檢測所有三個(gè)項(xiàng)目而達(dá)到改進(jìn)的目的，如簡化煩瑣的取樣過程和通過克服必需等待測定各檢測項(xiàng)目完成而減少檢測時(shí)間。實(shí)施例4傳感器芯片和簡易計(jì)數(shù)器的基礎(chǔ)響應(yīng)通過使用用于實(shí)施例1中制備的GE、MSUD和PKU檢測用的三種類型傳感器芯片和實(shí)施例3中生產(chǎn)的簡易計(jì)數(shù)器來測定基礎(chǔ)響應(yīng)值。
測定過程與實(shí)施例3中一致且安裝相應(yīng)的專用芯片，此后滴加相應(yīng)底物的標(biāo)準(zhǔn)溶液。一系列反應(yīng)的期限為120秒，然后進(jìn)行光學(xué)檢測且隨后依次進(jìn)行電化學(xué)檢測。由于電化學(xué)檢測包括甲的電解氧化，所以首先進(jìn)行不會(huì)產(chǎn)生改變的光學(xué)檢測。
然后比較相應(yīng)的光學(xué)與電化學(xué)響應(yīng)值。如果發(fā)現(xiàn)的差異滿足一定標(biāo)準(zhǔn)，那么將響應(yīng)值轉(zhuǎn)化成底物濃度并顯示結(jié)果。然而，如果該差異難以滿足所述標(biāo)準(zhǔn)，則顯示誤差。
光學(xué)檢測電路的組成使用具有590nm峰值波長的高效發(fā)光二極管(Nippon Hewlett Packard)作為光源和作為光檢測器的光二極管(Nippon Texas Instruments)。電化學(xué)檢測電路由不同半導(dǎo)體器件構(gòu)成。
在上述實(shí)施例中，對(duì)所述的傳感器芯片描述了特定的形狀，但對(duì)電極的形狀、電極、導(dǎo)線和絕緣層的排列、反應(yīng)試劑固定層的形狀和分布以及覆蓋板和墊板的形狀、排列和外形不作限制。
在與簡易計(jì)數(shù)器的連接中，說明了所述的特定形狀，但這種形狀并非是限制性的。
甚至為了實(shí)現(xiàn)在較高精確度下的檢測，將包括附加光源用于測定波長之外的參比波長的雙波長測定方法用于光學(xué)檢測并將添加參比電極的三電極系統(tǒng)測定方法用于電化學(xué)檢測。
權(quán)利要求
1.能夠同時(shí)檢測半乳糖血癥、槭糖尿病和苯丙酮酸尿癥這三種屬于先天性代謝異常疾病的檢測方法。
2.權(quán)利要求1的檢測方法，允許通過同時(shí)測定D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸來同時(shí)進(jìn)行檢測，所述的D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸是半乳糖血癥、槭糖尿病和苯丙酮酸尿癥中所測定的靶物。
3.權(quán)利要求1或2的檢測方法，允許在測定D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸的過程中，通過測定生物樣品與反應(yīng)試劑的酶反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)形成的甲濃度來同時(shí)進(jìn)行檢測，所述的反應(yīng)試劑至少包括D-半乳糖脫氫酶、L-亮氨酸脫氫酶和L-苯丙氨酸脫氫酶中的每一種、輔酶、電子介體和四唑鹽。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的檢測方法，其特征在于將所述的反應(yīng)試劑固定在試紙上，由此僅在接觸所述生物樣品時(shí)，所述反應(yīng)試劑溶解并混合且通過所述酶反應(yīng)和所述氧化還原反應(yīng)而形成所述甲。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的檢測方法，其特征在于可以通過使用光學(xué)方法和/或電化學(xué)方法測定所述甲。
6.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的檢測方法，其特征在于所述的光學(xué)方法測定通過施加所述甲的吸收波長產(chǎn)生的反射光的量。
7.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的檢測方法，其特征在于所述的電化學(xué)方法測定通過借助于電極系統(tǒng)給所述甲施加一定電位而產(chǎn)生的感應(yīng)電流。
8.帶有能夠同時(shí)檢測半乳糖血癥、槭糖尿病和苯丙酮酸尿癥這三種屬于先天性代謝異常疾病的裝置的檢測設(shè)備。
9.權(quán)利要求8的檢測設(shè)備，帶有能夠通過同時(shí)測定D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸來同時(shí)進(jìn)行檢測的裝置，所述的D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸是半乳糖血癥、槭糖尿病和苯丙酮酸尿癥中所測定的靶物。
10.權(quán)利要求8或9的檢測設(shè)備，其特征在于用于所述半乳糖血癥、槭糖尿病和苯丙酮酸尿癥這三種疾病的所述同時(shí)檢測方法應(yīng)用試紙和測定裝置。
11.權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其特征在于在所述測定D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸的過程中所述的試紙中固定有反應(yīng)試劑，所述的反應(yīng)試劑至少包括D-半乳糖脫氫酶、L-亮氨酸脫氫酶和L-苯丙氨酸脫氫酶中的每一種、輔酶、電子介體和四唑鹽。
12.權(quán)利要求8-11中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其特征在于所述的試紙帶有用于光學(xué)檢測的窗口和用于電化學(xué)檢測的電極系統(tǒng)。
13.權(quán)利要求8-12中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其特征在于所述的電極系統(tǒng)至少包括工作電極和對(duì)電極。
14.權(quán)利要求8-13中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其特征在于通過在所述測定裝置上安裝所述試紙來使用所述測定裝置，且該測定裝置帶有光學(xué)檢測電路和/或電化學(xué)檢測電路。
15.權(quán)利要求8-14中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其特征在于所述的光學(xué)檢測電路包括光源和光檢測器。
16.權(quán)利要求8-15中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，特征在于所述的電化學(xué)檢測電路包括電位施加電路和電流檢測電路。
17.權(quán)利要求8-16中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，特征在于所述的測定裝置具有自動(dòng)鑒定固定在所述裝置的固定部分上的物質(zhì)的功能。
18.權(quán)利要求8-17中任意一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其特征在于作為在所述測定D-半乳糖、包括L-亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸和L-苯丙氨酸中所測定的所述靶物，可以使用生物樣品，如血漿、血清、全血、唾液和尿、食物樣品和可以液化的其它樣品。
全文摘要
一種可方便并快捷地定量目標(biāo)物質(zhì)的方法，包括使用至少對(duì)包含于待測生物樣品中的物質(zhì)，即對(duì)包括D－半乳糖、L－亮氨酸和L－苯丙氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸具有特異性的相應(yīng)脫氫酶、輔酶、電子介體和四唑鹽作為反應(yīng)試劑，且利用光學(xué)檢測法和/或電化學(xué)檢測法之一或兩者來進(jìn)行最終通過所述生物樣品與所述反應(yīng)試劑之間的酶反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)而形成的甲的檢測，由此便利而快捷地測定了先天性代謝異常的三種疾病，即半乳糖血癥、械糖尿病和苯丙酮酸尿癥。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1461347SQ00819857
公開日2003年12月10日 申請日期2000年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月28日
發(fā)明者橫山撤, 筱塚直樹, 中村健治 申請人:札幌免疫診斷研究所