中，如對(duì)于A6TCR支架所示，可生成CDR文庫，其將與該等位 基因的替代性非同源肽-MHC復(fù)合物反應(yīng)。例如，來自MAGE-A3的癌抗原肽結(jié)合HLA-A1，并 且其可用于TR文庫的選擇。
[0176] 生物學(xué)活性基團(tuán)
[0177] 還提供了如本文描述的sc VaVPTCR支架，其包含生物學(xué)活性基團(tuán)的。本文 所用，"生物學(xué)活性基團(tuán)"是在生物系統(tǒng)中導(dǎo)致可測(cè)量或可檢測(cè)的效果的基團(tuán)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述生物學(xué)活性基團(tuán)選自：抗腫瘤劑，例如但不限于，血管發(fā)生抑制劑、酶抑 制劑、微管抑制劑、DNA嵌入劑或交聯(lián)劑、DNA合成抑制劑；細(xì)胞因子，例如但不局限于， IL-2、IL-15、GM-CSF、IL-12、TNF-a、IFN-Y 或 LT-a (Schrama 等（2006)Nat Rev Drug Discov，5，147-59;Wong 等（2011)Protein Eng Des Sel，24,373-83);抗炎性基團(tuán)，例 如但不限于，TGF-0、IL-37、IL-10(Nold 等（2010)Nat Immunol, 11，1014-22 ;Stone 等 (2012)Protein Engineering)，放射性同位素，例如但不局限于，9°Y或131I (Reichert和 Valge_Archer(2007)Nat Rev Drug Discov，6,349_56);毒素，例如但不局限于，假單胞菌 外毒素 A、白喉毒素或菌麻毒素 A 鏈（Pastan 等（2006)Nat Rev Cancer，6,559_65 ;Schrama 等（2006) Nat Rev Drug Discov, 5, 147-59);藥物，或抗體如單鏈 Fv。
[0178] 在本公開內(nèi)容該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物學(xué)活性基團(tuán)是細(xì)胞毒性分子， 有時(shí)稱為藥物（例如，在術(shù)語"抗體藥物綴合物"中）。本文所用的"細(xì)胞毒性"是指對(duì)細(xì) 胞有毒。細(xì)胞毒性分子的例子包括但不限于，多柔比星、甲氨蝶呤、絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、 倍癌霉素、阿里他?。╝uristatin)、美登素、卡奇霉素和上述分子的類似物（Jarvis (2012) Chemical and Engineering News, 90, 12-18 ;Litvak-Greenfeld和Benhar (2012)Adv Drug Deliv Rev ;Ricart 和Tolcher(2007)Nat Clin Pract Oncol, 4,245-55)。細(xì)胞毒性分子不 需要引起完全的細(xì)胞死亡，而是可測(cè)量或可檢測(cè)地抑制生長(zhǎng)的或降低細(xì)胞活性。
[0179] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的TCR與能夠?qū)⑺幬锴绑w轉(zhuǎn)化成藥物的酶連接。這 可用于例如使得能夠在TCR靶向的位置（例如，在腫瘤位點(diǎn)處）產(chǎn)生藥物的活性形式。
[0180] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過接頭使生物學(xué)活性基團(tuán)與單鏈TCR結(jié)合，這可通過與例 如TCR的自由胺基或巰基的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。
[0181] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，使TCR附著至單鏈抗體片段（scFv)以生成雙特異性的試 劑。現(xiàn)在已經(jīng)成功地在臨床上使用了包含一個(gè)針對(duì)腫瘤抗原的scFV和一個(gè)針對(duì)T細(xì)胞⑶3 分子的scFv的雙特異性抗體（Bargou等（2008) Science, 321，974-7)。此外，還報(bào)道了包含 針對(duì) CD3 的 TCR 和 scFv 的雙特異性試劑（Liddy 等（2012)Nat Med, 18, 980-7)。
[0182] 還提供了如本文描述的單鏈V a VPTCR，其包含可檢測(cè)基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述可檢測(cè)基團(tuán)是通過基于色譜或酶的方法可檢測(cè)的基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可檢 測(cè)基團(tuán)是熒光基團(tuán)，例如但不限于，熒光素、R-藻紅素（PE)、PE-Cy5、PE-Cy7、德克薩斯紅 (Texas red)或別藻藍(lán)素（APC);放射性標(biāo)記基團(tuán)，例如但不限于，^〖^^、"^(^吸收基團(tuán)， 或具有生成可檢測(cè)產(chǎn)物的性質(zhì)的酶，例如但不限于辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
[0183] 如本領(lǐng)域已知，可通過使用柔性肽接頭或化學(xué)綴合來使附著至TCR的生物學(xué)活性 基團(tuán)、可檢測(cè)基團(tuán)或其他基團(tuán)附著，并且所述基團(tuán)可通過共價(jià)或非共價(jià)的方式附著至TCR。
[0184] 抗原特異性
[0185] 本文還提供了識(shí)別（或靶向）特異性抗原的sc VaVPTCR支架。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述TCR特異地識(shí)別病毒或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TCR特異地識(shí)別癌 特異性表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TCR特異地識(shí)別自體免疫相關(guān)表位。其他靶標(biāo)包 括在HLA Factsbook(Marsh等（2000))中列舉的祀標(biāo)和本領(lǐng)域已知的其他祀標(biāo)。特異性 革巴抗原包括腫瘤相關(guān)抗原（van der Bruggen P 等 Peptide database:!1 cell-defined tumor antigens. Cancer Tmmun 2013. cancerimmunity. org/peptide/ ; (Cheever 等（2009) Clin Cancer Res, 15, 5323-37)，病毒抗原（Addo 等（2007)PL〇S ONE, 2, e321;Anikeeva 等（2009)Clin Immunol, 130, 98-109))，以及自體免疫相關(guān)表位（(Bulek 等（2012)Nat Immunol, 13,283-9 ;Harkiolaki 等（2009)Immunity, 30,348-57 ;Skowera 等（2008)J Clin Invest, 118, 3390-402)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述祀抗原是表1中列舉以下抗原中 的一種：MART-1 (Kawakami 等 J Exp Med 1994 ; 180:347-352 ;Romero 等 2002. Immunol. Rev. 188, 81-96)、WT-1(Gessler 等 Nature 343(6260)，774-778(1990) )、SURV(Schmidt SM 等 Blood 2003; 102:571-6 ;Schmitz 等 Cancer Res 2000;60:4845-9)、NY-ES〇-l(Barfoed 等 Scand J Immunol 2000 ；51:128-33) > PPI (Bulek 2012Nature Immunology) > MDM2 (Asai 等 2002Cancer Immunity)、MDM4、HBE183、gp100 (Bakker AB 等 Int J Cancer 1995; 62:97-102 ;Kawakami Y等 J Immunol 1995 ;154:3961-3968)、MUCl(Brossart P 等 Blood 1999;93:4309-17)、MAGE A3(van der Bruggen P 等 Eur J Immunol 1994;24:3038-43)、 HER-2/neu(Fisk B 等 J Exp Med 1995 ;181:2109-2117)、EGVFvIII(Sampson Semin Immunol 2008;20:267-75)、CEA(Tsang KY 等 J Natl Cancer Inst 1995;87:982-990)和 SL9/HIV gag(Altfeld 等 2001 J. Virol. 75:1301)。表 1 中的評(píng)分來自 Cheever 等（2009) Clin Cancer Res, 15,5323-37。還提供了來源于A6支架的識(shí)別特異性非同源抗原的 scV a V 旦 TCR 突變體，稱為 MART-1/HLA-A2 (肽 ELAGIGILTV，SEQ ID N0:7,與 HLA 分子 A2 結(jié) 合）。
[0186] 表1.祀抗原
[0187]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體或其抗原結(jié)合片段，其包含源自野生型T細(xì)胞受體的V a和 V目，其中所述Va、所述V目或二者相對(duì)于所述野生型T細(xì)胞受體包含在一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決 定區(qū)（CDR)中的突變，其中所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體結(jié)合至不被所述野生型T細(xì)胞受體結(jié) 合的非同源膚-MHC。
2. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述野生型T細(xì)胞受體包含SEQ ID NO: 1所示的V a氨基酸序列和SEQ ID NO: 2所示的V目氨基酸序列。
3. 如權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其包含經(jīng)修飾的V a和經(jīng)修飾的V目，所 述經(jīng)修飾的V a含有與SEQ ID NO: 1所示的V a氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸 序列，所述經(jīng)修飾的V目含有與SEQ ID NO: 2所示的V目氨基酸序列具有至少80%同一性 的氨基酸序列，其中所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體不結(jié)合被所述野生型T細(xì)胞受體結(jié)合的同源 膚-M肥。
4. 如權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體包含在W 下的一個(gè)或多個(gè)中的氨基酸替換；CDRlaSl、CDR3a98、CDR3目99、CDR3a97、CDR3目102、 CDR3 a 99、CDR3 目100、CDR3 目101、CDR1a 32、CDR1目 30、CDR3 目 98。
5. 如權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體包含在 CDR2 a 51位的野生型氨基酸。
6. 如權(quán)利要求5所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體還包含在 CDR1 a 31位的野生型氨基酸。
7. 如權(quán)利要求6所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體還包含在 CD 1 a 28和CD 1 a 52位的野生型氨基酸。
8. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述野生型T細(xì)胞受體是包含SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的單鏈T細(xì)胞受體A6-X15。
9. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述非同源的膚-M肥包含 Mart 1: HLA. A2、化9HIV: HLA. A2、WT-1: HLA. A2 或 SURV: HLA. A2。
10. 如權(quán)利要求9所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其包含；1)含有與SEQ ID N0:33、41或 42中的一個(gè)所示的氨基酸序列的V a區(qū)具有至少90%同一性的氨基酸序列的經(jīng)修飾的V a 區(qū)，W及2)含有與SEQ ID N0:33、41或42中的一個(gè)所示的氨基酸序列的V目區(qū)具有至少 90%同一性的氨基酸序列的經(jīng)修飾的V目區(qū)。
11. 如權(quán)利要求10所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其包含SEQ ID N0:33、41或42中的一 個(gè)所示的氨基酸序列。
12. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中通過T細(xì)胞受體突變體的酵母菌展 示文庫的體外選擇來產(chǎn)生所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體。
13. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述野生型T細(xì)胞受體是人T細(xì)胞 受體。
14. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體是單鏈T 細(xì)胞受體。
15. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體，其中所述野生型T細(xì)胞受體結(jié)合 HLA-A2。
16. 編碼權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體的多膚。
17. 編碼權(quán)利要求16所述的多膚的多核巧酸。
18. 經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體或其抗原結(jié)合片段，其包含源自野生型T細(xì)胞受體的V a和 V目，其中所述V a包含SEQ ID N0:34的140-256位氨基酸殘基，并且其中所述V目包含 SEQ ID NO:34的1-122位氨基酸殘基。
19. 經(jīng)修飾的T細(xì)胞受體或其抗原結(jié)合片段，其包括源自野生型T細(xì)胞受體的V a和 V目，其中所述V a包含SEQ ID NO: 43的140-255位氨基酸殘基，并且其中所述V目包含 SEQ ID N0:43的1-122位氨基酸殘基。
20. 用于工程化具有期望特異性的T細(xì)胞受體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括： a) 分離編碼野生型T細(xì)胞受體或其抗原結(jié)合片段的多核巧酸； b) 產(chǎn)生T細(xì)胞受體突變體或其抗原結(jié)合片段的文庫，其中所述T細(xì)胞受體突變體或其 抗原結(jié)合片段相對(duì)于所述野生型T細(xì)胞受體包含在一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)中的突變； C)在表面展示系統(tǒng)中表達(dá)所述T細(xì)胞受體突變體；W及 d)選擇結(jié)合至非同源膚-MHC的T細(xì)胞受體突變體。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述野生型T細(xì)胞受體包含SEQ ID NO: 1所示的 V a氨基酸序列和SEQ ID NO: 2所示的V目氨基酸序列。
22. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述野生型T細(xì)胞受體是包含SEQ ID NO:3所示 的氨基酸序列的單鏈T細(xì)胞受體A6-X15。
23. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述表面展示系統(tǒng)是酵母菌展示系統(tǒng)。
24. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述非同源的膚-MHC是Marti:HLA. A2、 SL9HIV: HLA. A2、WT-1: HLA. A2 或 SURV: HLA. A2。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其還包括親和力成熟的步驟。
【專利摘要】本發(fā)明提供了模型T細(xì)胞受體(TCR)作為支架用于針對(duì)新特異性進(jìn)行體外工程化的用途?？赏ㄟ^以下來分離具有新生的與特異性肽-主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的結(jié)合的TCR：1)誘變T細(xì)胞受體蛋白編碼序列以生成多樣化的突變體群(文庫)，2)使用定向進(jìn)化方法和“展示”方法(例如，酵母菌、噬菌體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)以及肽-MHC配體，用特異性肽-MHC選擇TCR突變體文庫?？芍貜?fù)該方法以鑒定對(duì)選擇的肽-MHC配體具有提高的親和力的TCR變體。
【IPC分類】C07K14-725, C12N15-12
【公開號(hào)】CN104684926
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380050450
【發(fā)明人】希娜·N·史密斯, 大衛(wèi)·M·克蘭澤
【申請(qǐng)人】伊利諾伊州大學(xué)理事會(huì)
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2013年7月26日
【公告號(hào)】CA2880098A1, EP2877489A1, US20150191524, WO2014018863A1