工程化t細胞受體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開內(nèi)容涉及T細胞受體（TCR)支架（scaffold)和TCR文庫，以及生產(chǎn)經(jīng)修飾 的TCR和單鏈TCR的方法，以及TCR用于治療方法、診斷方法和成像方法的相應用途。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請基于35U.S.C. § 119(e)要求于2012年7月27日提交的美國臨時專利申 請No. 61/676, 373的權(quán)益，并且將該申請通過整體引用并入本文。
[0004] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
[0005] 本公開內(nèi)容是通過由美國國立衛(wèi)生研究院給予的基金號R01GM55767和 T32GM070421的美國政府資助來完成的。美國政府在本公開內(nèi)容中具有一些權(quán)利。
[0006] 關(guān)于序列表的聲明
[0007] 以文本格式替代紙質(zhì)拷貝來提供與本申請相關(guān)的序列表，并且在此通過引用將該 序列表并入本說明書。包含所述序列表的文本文檔名為IMMU_002_01W0_ST25. txt。該文本 文檔65KB，創(chuàng)建于2013年7月26日，并且經(jīng)EFS-Web進行電子提交。
[0008] 發(fā)明背景
[0009] T細胞受體（TCR)和抗體是已發(fā)展成識別不同抗原（配體）類型的分子 ((Murphy (2012)，xix，868p.))。TCR是抗原特異性分子，其負責識別抗原呈遞細胞（APC)或 任何有核細胞（例如，身體內(nèi)除紅細胞外的所有人細胞）表面上在主要組織相容性復合物 (MHC)產(chǎn)物的環(huán)境下呈遞的抗原性肽。相反，抗體通常識別可溶性抗原或細胞表面抗原，并 且不需要MHC進行抗原呈遞。該系統(tǒng)通過T細胞的TCR賦予T細胞識別由細胞表達的細胞 內(nèi)抗原（包括病毒蛋白質(zhì)）的完整陣列，所述細胞內(nèi)抗原在細胞內(nèi)被加工成短肽，結(jié)合至細 胞內(nèi)MHC分子，并作為肽-MHC復合物（pepMHC)遞送至表面。該系統(tǒng)幾乎允許任何外源蛋白 質(zhì)（例如，突變的癌抗原或病毒蛋白質(zhì)）或異常表達的蛋白質(zhì)用作T細胞的靶標（在（Davis 和Bjorkman (1988)Nature, 334, 395-402 ;Davis等，（1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012)，xix，868p.)中綜述）。
[0010] 基于結(jié)合親和力（或解離速率），TCR與p印MHC的相互作用可使T細胞進入多種 活化狀態(tài)。通過提供多種TCR指令，TCR識別過程使T細胞能夠區(qū)分正常健康的細胞和例如 被病毒轉(zhuǎn)化了的細胞或惡性細胞，其中高概率情況的是，一種或多種TCR具有針對結(jié)合至 MHC分子的外源蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力，所述MHC分子高于刺激T細胞活性的閾值（Manning 和 Kranz(1999)Immunology Today, 20, 417-422)。
[0011] 迄今為止，從通過體外培養(yǎng)鑒定的人T細胞克隆或小鼠T細胞克隆分離的野生 型TCR，已顯示具有相對較低的結(jié)合親和力（KD = 1 - 300 ii M) (Davis等，（1998) Annu Rev Immunol，16, 523-544)。這種情況的部分解釋似乎是，在胸腺中發(fā)育的T細胞被自體p印MHC 配體負向選擇（耐受誘導），使得具有太高親和力的T細胞被去除（Starr等，（2003) Annu Rev Immunol, 21，139-76)。為了補償這些相對低的親和力，T細胞發(fā)展出共受體系統(tǒng)，其中 細胞表面分子CD4和CD8結(jié)合至MHC分子（分別為II型和I型），并且增強TCR的介導信 號轉(zhuǎn)導活性。CD8在該過程中特別有效，其使具有非常低的親和力（例如，K D= 300 yM)的 TCR能夠介導強效的抗原特異性活性。
[0012] 已經(jīng)使用定向進化來產(chǎn)生對特異性pepMHC具有更高親和力的TCR。已經(jīng) 使用的三種不同展示方法是酵母菌展示（Holler等，（2003)Nat Immunol, 4,55-62; Holler 等，（2000)Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92)、噬菌體展示（Li 等， (2005)Nat Biotechnol, 23,349-54)和 T 細胞展不（Chervin 等，（2008)J Immunol Methods, 339, 175-84)。在所有三種方法中，該方法涉及對表現(xiàn)出正常的低親和力的野生型 TCR進行工程化或修飾，從而使TCR突變體的親和力具有針對同源pepMHC (T細胞對其具有 特異性的原始抗原）的升高的親和力。因此，使用野生型TCR作為產(chǎn)生在一個或多個CDR中 誘變的文庫的模板，并且，通過結(jié)合至同源肽-MHC抗原來選擇具有更高親和力的突變體。
[0013] 這些TCR工程化方法的每一個的主要問題是，它們需要從對特異性肽抗原具有反 應性的T細胞克隆分離的不同TCR，以開發(fā)對所述肽抗原（同源抗原）或其結(jié)構(gòu)類似的變體 具有特異性的更高親和力的TCR突變體。由于存在超過300種來自多種癌癥的確定的肽抗 原以及許多來自病毒的抗原，采用體外工程技術(shù)，如果能使用相同的TCR作為平臺以產(chǎn)生 針對結(jié)構(gòu)非常不同的抗原（稱為非同源抗原）的TCR將是非常有利的。本發(fā)明滿足了這些 以及更多的需要。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明涉及T細胞受體（TCR)支架，其可用于，例如并且僅以例子的方式，產(chǎn)生具 有新的結(jié)合特異性的產(chǎn)物。更具體地，本發(fā)明涉及在酵母菌、噬菌體或哺乳細胞表面上展 示的T細胞受體蛋白文庫；涉及選自用于結(jié)合至不被原始TCR識別的非同源抗原的文庫的 TCR蛋白；并且涉及體外選擇的用于治療應用、診斷應用或成像應用的TCR蛋白的用途。
[0016] 本發(fā)明的一個方面涉及經(jīng)修飾的T細胞受體或其抗原結(jié)合片段，其包含源自野生 型T細胞受體的Va和VP，其中所述Va、所述VP或二者相對于所述野生型T細胞受體 包含在一個或多個互補決定區(qū)（CDR)中的突變，其中所述經(jīng)修飾的T細胞受體結(jié)合至不被 所述野生型T細胞受體結(jié)合的非同源肽-MHC。
[0017] 在一個實施方案中，所述野生型T細胞受體包含SEQ ID NO: 1所示的V a氨基酸 序列和SEQ ID NO:2所示的VP氨基酸序列。在一個相關(guān)實施方案中，所述經(jīng)修飾的T細 胞受體包含經(jīng)修飾的V a和經(jīng)修飾的V 0，所述經(jīng)修飾的V a含有與SEQ ID NO: 1所示的 Va氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，所述經(jīng)修飾的VP含有與SEQ ID N0:2 記載所示的VP氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，其中所述經(jīng)修飾的T細 胞受體不結(jié)合被所述野生型T細胞受體結(jié)合的同源肽-MHC。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾 的T細胞受體包含在以下的一個或多個中的氨基酸替換：⑶R1 a 31、⑶R3 a 98、⑶R3 099、 CDR3 a 97、CDR3 P 102、CDR3 a 99、CDR3 P 100、CDR3 P 101、CDR1 a 32、CDR1 P 30、CDR3 P 98。 在另一個實施方案中，所述經(jīng)修飾的T細胞受體包含在CDR2 a 51位的野生型氨基酸。在一 個實施方案中，所述經(jīng)修飾的T細胞受體還包含在CDR1 a 31位的野生型氨基酸。在一個相 關(guān)實施方案中，所述經(jīng)修飾的T細胞受體還包含在⑶1 a 28和⑶1 a 52位的野生型氨基酸。
[0018] 在一個實施方案中，所述野生型T細胞受體是包含SEQ ID N0:3所示的氨基酸序 列的單鏈T細胞受體A6-X15。在另一個實施方案中，所述非同源的肽-MHC包含Mart 1: HLA. A2、SL9HIV:HLA. A2、WT-1:HLA. A2或SURV:HLA. A2。在一個相關(guān)實施方案中，所述經(jīng)修飾的 T細胞受體包含：1)含有與SEQ ID N0:33、41或42中的一個所示的氨基酸序列的Va區(qū)具 有至少90%同一性的氨基酸序列的經(jīng)修飾的V a區(qū)，以及2)含有與SEQ ID NO: 33、41或 42中的一個所示的氨基酸序列的V 0區(qū)具有至少90%同一性的氨基酸序列的經(jīng)修飾的V 3 區(qū)。在某些實施方案中，所述氨基酸序列如SEQ ID N0:33、41或42中一個所示。
[0019] 在另一個實施方案中，通過T細胞受體突變體的酵母菌展示文庫的體外選擇來產(chǎn) 生所述經(jīng)修飾的T細胞受體。在一個實施方案中，所述野生型T細胞受體是人T細胞受體。 在另一個實施方案中，所述經(jīng)修飾的T細胞受體是單鏈T細胞受體。在另一個實施方案中， 所述野生型T細胞受體結(jié)合HLA-A2。在一個實施方案中，提供了編碼所述經(jīng)修飾的T細胞 受體的多肽。在一個相關(guān)實施方案中，提供了編碼所述多肽的多核苷酸。
[0020] 本發(fā)明的另一個方面提供了經(jīng)修飾的T細胞受體或其抗原結(jié)合片段，其包括源自 野生型T細胞受體的V a和V 0，其中所述V a包含SEQ ID N0:34的140-256位氨基酸殘 基，并且其中所述VP包含SEQ ID N0:34的1-122位氨基酸殘基。
[0021] 本發(fā)明的另一個方面提供了經(jīng)修飾的T細胞受體或其抗原結(jié)合片段，其包括源自 野生型T細胞受體的Va和，其中所述Va包含SEQ ID N0:43的140-255位氨基酸殘 基，并且其中所述VP包含SEQ ID N0:43的1-122位氨基酸殘基。
[0022] 本發(fā)明的一個方面提供了用于工程化具有期望特異性的T細胞受體或其抗原結(jié) 合片段的方法，其包括：a)分離編碼野生型T細胞受體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸；b) 產(chǎn)生T細胞受體突變體或其抗原結(jié)合片段的文庫，其中所述T細胞受體突變體或其抗原結(jié) 合片段相對于所述野生型T細胞受體包含在一個或多個互補決定區(qū)中的突變；c)在表面展 示系統(tǒng)中表達所述T細胞受體突變體；以及d)選擇結(jié)合至非同源肽-MHC的T細胞受體突 變體。
[0023] 在一個實施方案中，所述野生型T細胞受體包含SEQ ID NO: 1所示的V a氨基酸序 列和SEQ ID N0:2所示的VP氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述野生型T細胞受體是 包含SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的單鏈T細胞受體A6-X15。在一個實施方案中，所述表 面展示系統(tǒng)是酵母菌展示系統(tǒng)。在另一個實施方案中，所述非同源的肽-MHC是Marti :HLA. A2、SL9HIV:HLA. A2、WT-1:HLA. A2或SURV:HLA. A2。在一個實施方案中，所述方法還包括親 和力成熟步驟。
【附圖說明】
[0024] 圖1示出了合理設(shè)計用于工程化對非同源抗原特異具有更高親和力的TCR的單一 支架的方法。
[0025] 圖2A是示出A6TCR:p印MHC復合物（A6 ;PDB: 1A07)的結(jié)構(gòu)視圖的3維圖。標出 了 a-鏈和鏈的可變（V)區(qū)和恒定（C)區(qū)。所示出的結(jié)構(gòu)不包括A6TCR的Ca區(qū)。 HLA-A2 ( a 1、a 2、a 3 和 P 2m)以灰色示出，并且 Tax 肽（LLFGYPVYV ;SEQ ID N0:5)以黑色 示出。
[0026] 圖2B是示出肽-MHC (Tax-HLA. A2)上的CDR足跡的3維圖。
[0027] 圖3是A6wt中相應的肽的3.0A內(nèi)5種最多遇到的殘基的足跡覆蓋。
[0028] 圖4A描述了包含Va 2的TCR的晶體結(jié)構(gòu)，并且示出了預測的在TCR⑶R1 a和 CDR2 a 環(huán)中的關(guān)鍵性 MHC 接觸位置（從（Borbulevych 等（2011) J Immunol, 187,2453-63) 修飾而得）。
[0029] 圖4B示出了高親和力的A6TCR X15和4種變體與多種濃度的Tax (LLFGYPVYV，SEQ ID N0:5) :HLA_A2二聚體（DimerX;得自BD Pharmingen)的結(jié)合，其中每個變體都在四個殘 基中的一個處含有丙氨酸替換。
[0030] 圖5示出了 A6V@ (SEQ ID N0:2)和Va (SEQ ID N0:1)區(qū)的氨基酸序列，并且以 灰色打陰影的位置指示在穩(wěn)定變體A6-X15(SEQ ID N0:3)中構(gòu)建了經(jīng)簡并的文庫的地方。 標記了每個V結(jié)構(gòu)域的CDR，并且還示出了在酵母菌展示載體中連接兩個V區(qū)的接頭的序 列。
[0031] 圖6是使用酵母菌展示的單鏈T細胞受體（scTCR)的示意圖。
[0032] 圖7示出了從人A6X15scTCR簡并文庫（RD1文庫）中選擇的十個克隆的氨基酸序 列對齊。
[0033] 圖8示出了在用同源抗原（Tax:HLA.A2)進行分選后，RD1文庫的流式細胞柱狀圖。 灰色指示僅用二抗染色的酵母菌細胞。
[0034] 圖9示出了在用同源抗原（Marti :HLA. A2)進行分選后RD1文庫的流式細胞柱狀 圖。灰色指示僅用二抗染色的酵母菌細胞。
[0035] 圖10A示出了在用同源配體Tax(LLFGYPVYV ;SEQ IDN0:5):HLA-A2二聚體進行第 4次分選后分離的六個克隆的序列對齊。
[0036] 圖10B示出了處于簡并位置的六個RD1支架變體的DNA序列對齊。每個密碼子下 面是由該密碼子以NNS文庫中的一些可能的密碼子組合編碼的氨基酸。
[0037] 圖11A是描述用針對N末端標簽的抗-HA抗體進行的陽性染色，從而指示AGA2融 合物的表面表達的柱狀圖。用抗-HA抗體和山羊抗小鼠IgG alexa 647二抗染色細胞（黑 線柱狀圖），或僅用二抗染色細胞作為對照（灰色填充的柱狀圖）。在所有酵母菌展示實驗 中都觀察到HA染色細胞（黑線）的負峰值，這是由于酵母菌已經(jīng)失去質(zhì)粒所致，并且該負 峰值充當每個誘導的酵母菌樣品的內(nèi)參。
[0038] 圖11B是示出當該克隆沒有C-末端c-myc標簽時，c-myc的陰性染色的柱狀圖。 用雞抗c-myc抗體和山羊抗雞IgY alexa 647二抗染色細胞，或僅用二抗染色細胞作為對 照（灰色）。
[0039] 圖11C是示出用多種濃度的選擇性同源抗原Tax:HLA.A2二聚體以指定濃度對 A6-X15克隆染色的柱狀圖。
[0040] 圖11D是示出用多種濃度的非選擇性非同源抗原Martl:HLA.A2對A6-X15克隆染 色的柱狀圖。
[0041] 圖11E是來自用4-500nM