基于特異性ss-coi引物的棉黑蚜pcr快速檢測方法
【專利說明】基于特異性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速檢測方法 一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及棉黑蚜PCR檢測方法，具體為一種基于特異性 C0I引物的PGR檢測方法。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 棉黑財（Aphis atrata Zhang)屬同翅目，財科。又稱紫團(tuán)財。分布于新疆、寧夏、 甘肅等地。寄主植物有棉花、苦豆子，少量在苜蓿上。
[0003] 棉黑蚜是新疆棉花苗期害蟲，喜群集于棉苗嫩頭、子葉、真葉反面吸食汁液為害， 使棉葉皺縮，生長點枯萎脫落，腋芽叢生，棉株矮化畸形，使棉苗發(fā)育早期停滯，花蕾減少， 產(chǎn)量下降。
[0004] 利用自然天敵對田間害蟲進(jìn)行生物防治，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植保工作的有效手段之 一。捕食性天敵對蚜蟲具有明顯的捕食作用，研宄天敵對蚜蟲捕食作用的方法很多，傳統(tǒng)的 方法主要采用田間直接觀察，消化道解剖觀察、以及生化方法，如酶聯(lián)免疫法（ELISA)、同功 酶電泳、蛋白質(zhì)電泳分析等，但這些方法都有耗時長、操作復(fù)雜、費用高等局限性。目前，DNA 追蹤技術(shù)被逐步應(yīng)用到研宄田間天敵和害蟲的食物鏈營養(yǎng)關(guān)系以及篩選優(yōu)勢天敵方面，是 構(gòu)建復(fù)雜的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中節(jié)肢動物間食物網(wǎng)的有效工具之一。
[0005] Species-Specific-COI PCR檢測技術(shù)是在mtDNACOI技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特 異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用物種特異性C0I引物（SS-C0I)，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來鑒 定檢測樣本，無需測序和序列比對，其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快速、簡便等優(yōu) 點。中國專利說明書CN103436618A公開的棉蚜特異性SS-C0I引物、含有該引物的試劑盒 及其檢測方法即是該方法的具體應(yīng)用。
[0006] 但棉黑蚜由于分布區(qū)域有限，相關(guān)研宄開展較少，在Genbank上尚未檢索到棉黑 蚜C01基因片段。因此該方法尚未在棉黑蚜的檢測方面得以應(yīng)用。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種基于特異性SS-C0I引物的棉黑蚜PCR快速檢測方法。
[0008] 本發(fā)明根據(jù)棉黑蚜的線粒體DNA C0I序列，設(shè)計一對棉黑蚜的特異性C0I引物，具 體為
[0009] 正向引物 Aal05-1F :5' -TCCCATAATAATAGGTTGTC-3'
[0010] 反向引物 Aal05-1R :5' -TACCTGCTAAATGAAGAGAG-3'。
[0011] 本發(fā)明的檢測步驟為：
[0012] (1)提取樣品總DNA;
[0013] (2)以上述步驟提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物Aal05-1F和 Aal05-1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)體系以20 y L計為：
[0014]
【主權(quán)項】
1. 一種基于特異性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速檢測方法，其特征在于所述的引物為 正向引物 Aal05-1F :5' -TCCCATAATAATAGGTTGTC-3' 反向引物 Aal05-1R :5' -TACCTGCTAAATGAAGAGAG-3' 檢測步驟為： a. 提取樣品總DNA ; b. 以上述步驟提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物Aal05-1F和Aal05-1R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)體系以20 μ L計為：
反應(yīng)條件為：94°C 3分鐘，94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 1分鐘，共45個循環(huán)；之后 72 °C 10 分鐘。 c. 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)大小為2IObp的DNA條帶，則表明 樣品為棉黑蟲牙。
2. 含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測棉黑蚜的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包 括棉黑蚜基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
【專利摘要】基于特異性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速檢測方法，是根據(jù)棉黑蚜特有的mtDNA COI序列，設(shè)計了一對棉黑蚜特異性的COI引物Aa105-1F和Aa105-1R，該引物只對棉黑蚜具有特異性擴(kuò)增效果，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為210bp，DNA最低檢出濃度為0.192ng/μL。用于植保領(lǐng)域棉黑蚜優(yōu)勢天敵確定及食物鏈分析，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高，方便快捷。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104673890
【申請?zhí)枴緾N201410697874
【發(fā)明人】王冬梅, 丁瑞豐, 劉建, 李海強(qiáng), 李號賓, 徐遙, 阿克旦, 汪飛, 李廣闊
【申請人】新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2014年11月19日