一種生物轉(zhuǎn)化菌絲體及其提取物在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"（正文中的引號 表示對菌絲體的特指）及其提取物在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液凝固（blood coagulation)是指血液由流動的液體狀態(tài)變成不能流動的凝膠 狀態(tài)的過程，是生理性止血過程的重要環(huán)節(jié)。血液凝固的實(shí)質(zhì)就是血漿中的可溶性纖維蛋 白原轉(zhuǎn)變成不溶性的纖維蛋白的過程。當(dāng)形成的纖維蛋白交織成網(wǎng)時，可把血細(xì)胞及血液 的其他成分網(wǎng)羅在內(nèi)，從而形成血凝塊。血液凝固是一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程，需要多種 凝血因子的參與。凝血酶原的激活是在凝血酶原酶復(fù)合物作用下進(jìn)行的。因此，凝血過程 可分為凝血酶原酶復(fù)合物的形成、凝血酶原激活和纖維蛋白生成三個基本過程。凝血酶原 酶復(fù)合物的形成有內(nèi)源性凝血和外源性凝血兩條途徑。
[0003] 內(nèi)源性凝血途徑當(dāng)血液與帶負(fù)電荷的膠原蛋白（皮膚血管外壁）或異體表面（如 高嶺土、玻璃等）接觸時，因子XH就由酶原激活成xn a，后者除能激活因子XI外，又同時使 血漿前緩激肽釋放酶激活。激活后的激肽釋放酶在高分子量激肽原的促進(jìn)下反過來又進(jìn)一 步使因子XH激活，但此時不再是接觸激活而是肽鍵水解激活，使成為因子XHf。這是一正 反饋效應(yīng)，不論XHa或XHf?都具有相同的活力。激活后的XHa在Ca 2+存在下接著又使因子 IX激活?；罨囊蜃覫X a在Ca2+與磷脂存在下與因子VDI形成復(fù)合物，使因子X激活為因子 X a。激活后的因子X與Ca2+、磷脂及因子V共同形成一復(fù)合物，后者最終使凝血酶原激活 為凝血酶?；罨哪改苁箍扇苄岳w維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的纖維蛋白。本次采用的體 外試管法測定凝血活性，原理也即家兔全血接觸玻璃試管后，啟動內(nèi)源性凝血通路，最終導(dǎo) 致血凝塊的形成。
[0004] 外源性凝血途徑體內(nèi)組織損傷時釋放出因子III，也稱為組織因子。在Ca2+存在下 它能與血液中已活化的因子VDI形成復(fù)合物，就能使因子X激活，此后就與內(nèi)源性激活途徑 的反應(yīng)步驟相同。通過外源性途徑血液凝固在10多秒鐘內(nèi)即可完成，而通過內(nèi)源性途徑則 需數(shù)分鐘。
[0005]地龍（Geosaurus)，為環(huán)節(jié)動物門鉅蚓科動物參環(huán)毛蝴、通俗環(huán)毛蝴、威廉環(huán)毛蚓 或櫛肓毛蚓的干燥體，在《本草綱目》稱之為具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、預(yù)防治療心腦血管 疾病作用。地龍能制備出含多種纖溶酶和纖溶酶原激活物的制劑，具有良好的溶解血栓作 用，可使兔血漿組織型纖溶酶原激活物（t?PA)活力增加，血小板聚集性顯著降低，全血粘 度和血漿粘度降低，紅細(xì)胞剛性指數(shù)降低，提示其通過促進(jìn)纖溶、抑制血小板聚集、增強(qiáng)紅 細(xì)胞膜穩(wěn)定性等發(fā)揮作用。蚯蚓干粉水浸液在體外對家兔纖維蛋白和凝血塊均有溶解作 用。家兔靜注水煎醇沉注射液對耳緣靜脈血栓有明顯溶解作用。正常志愿者口服蚯蚓提取 物亦有明顯的抗凝和纖溶作用，且與劑量相關(guān)。凝血活酶時間明顯延長，纖溶酶原激活物活 性增強(qiáng)，代球蛋白溶解時間縮短及纖維蛋白降解產(chǎn)物含量增加。從蚯蚓提取的纖溶酶（凍 干粉）給家兔灌胃，0. 〇5g/(kg ?(!)或0. lg/(kg ?(!)，連續(xù)3d，從心臟取血，在體外形成的血 栓長度、濕重、干重均較對照組明顯減少。
[0006] 猴頭菌絲體中的活性物質(zhì)最重要的是多糖及糖蛋白，目前國內(nèi)外對猴頭多糖的研 宄表明，猴頭菌多糖具有多種生物活性和藥理作用，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)溶血 素的形成，抗白細(xì)胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突變和抗衰老等。因此，猴頭菌多糖備 受人們關(guān)注，成為近年來分子生物學(xué)、醫(yī)藥、食品科學(xué)等領(lǐng)域研宄和開發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)?！逗?省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年版，122?123頁記載了猴頭菌培養(yǎng)物，本發(fā)明所述的猴頭菌絲體是 該標(biāo)準(zhǔn)記載的猴頭菌培養(yǎng)物。
[0007]生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"是指利用菌絲體（包括真菌）的代謝功能，使有機(jī)物分解的生 物化學(xué)反應(yīng)過程。以適宜的培養(yǎng)基為營養(yǎng)，通過菌絲體的生長代謝和生命活動產(chǎn)生豐富的 次生代謝產(chǎn)物。借鑒中醫(yī)藥組方思想，將單味中藥、具有類似或協(xié)同作用的中藥作為部分培 養(yǎng)基進(jìn)行菌絲體轉(zhuǎn)化，目的是產(chǎn)生新化合物、增強(qiáng)功效或者降低單一藥物不良作用。
[0008] 據(jù)文獻(xiàn)記載，猴頭菌絲體具有抗凝血作用，但作用并不明顯，而地龍的很多抗凝血 活性物質(zhì)均為酶類，現(xiàn)有的處理方法制備的地龍中藥材無論是加工過程還是保存條件都大 大損害了其中的酶活物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"及其提取物。
[0010] 所述一種生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"的培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0011] 麥麩65?75 ;玉米面15?25 ;谷糠7?11 ;白糖0. 8?1. 2 ;地龍25?150 ;水 68. 75 ?150。
[0012] 優(yōu)選地，所述的菌絲體培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0013]麥麩70;玉米面20;谷糠9;白糖1;地龍25?150;水68. 75?150。
[0014]更優(yōu)選地，所述的菌絲體培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0015]麥麩70;玉米面20;谷糠9;白糖1;地龍66. 67;水100。
[0016] 所述的一種生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"是將猴頭菌接種至上述培養(yǎng)基中，在20?27°C條 件下菌絲體轉(zhuǎn)化30?40天，取出轉(zhuǎn)化物，烘干，即得。
[0017] 所述這種生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"的提取物通過如下步驟制得：
[0018] (1)將上述生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"進(jìn)行第一次水常溫閃式提取，提取15?25分鐘，優(yōu) 選20分鐘，然后進(jìn)行第二次水常溫閃式提取，提取15?25分鐘，優(yōu)選20分鐘；第一次水常 溫閃式提取中，水的重量為生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"重量的4?6倍，優(yōu)選5倍；第二次水常溫閃 式提取中，水的重量為生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"重量的2?4倍，優(yōu)選3倍；
[0019] (2)將提取后獲得的提取液尚心后得到的上清液在55?60°C，優(yōu)選60°C條件下減 壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在-60?_55°C，優(yōu)選_60°C條件下真空冷凍干燥，即得生 物轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物。
[0020] 其中，步驟（1)所述水常溫閃式提取的溫度為20?50°C ;步驟（2)中所述提取液 離心條件為：轉(zhuǎn)速3500?4500轉(zhuǎn)/分鐘，離心8?15分鐘。
[0021] 所述生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物能用于制備抗凝血藥物。
[0022] 本發(fā)明所述猴頭菌為猴頭菌科真菌猴頭菌Hericium erinaceum(Bull, ex Fr.) Pers.，是市售的商業(yè)化的菌種；本發(fā)明所述猴頭菌絲體是《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年 版，122?123頁記載的猴頭菌培養(yǎng)物，猴頭菌絲體為猴頭菌科真菌猴頭菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers.的菌絲體與其附生固體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基均為農(nóng)副產(chǎn) 品）的干燥混合物；本發(fā)明所述的生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"為猴頭菌科真菌猴頭菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr. )Pers.的菌絲體與其附生含有地龍成份固體培養(yǎng)基的干燥混合 物。
[0023] 猴頭菌絲體具有較弱抗凝血作用，地龍的抗凝血活性在加工過程中大大損失。猴 頭菌是一種藥用真菌，能很好地吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)，徹底轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，產(chǎn)生新的活性物質(zhì)及 代謝物，為此，本發(fā)明將地龍加入到培養(yǎng)基中，猴頭菌對地龍進(jìn)行中藥菌絲體轉(zhuǎn)化，得到新 的菌絲體（即：生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"），本發(fā)明對所得的生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物進(jìn)行了體 外