一種毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃酮碳苷提取和純化工藝，具體涉及一種毛竹葉中四種黃酮碳苷 提取和純化工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃酮類化合物因其結(jié)構(gòu)和來源不同，溶解特性也有很大差異，因此可根據(jù)極性選 擇合適的溶劑進(jìn)行提取。目前，提取方法主要有：水提法、堿性水或稀醇提取法、有機(jī)溶劑熱 回流提取法、微波輔助萃取法、超聲波提取法、超臨界萃取法等。
[0003] 水提法，用于黃酮苷類物質(zhì)提取，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)，但提取液中含蛋白質(zhì)、 多糖等溶于水的雜質(zhì)，提取效率低，易霉變，后續(xù)分離麻煩。堿性水或稀醇提取法，利用黃酮 類化合物中酚羥基基團(tuán)溶于堿水遇酸后又沉淀析出的特點(diǎn)，用于黃酮類化合物的提取。在 提取過程中，加入的酸堿濃度要適量，堿濃度過高會破壞黃酮母核結(jié)構(gòu)，而酸濃度過高又會 與黃酮的羥基生成佯鹽，導(dǎo)致沉淀物析出后重新溶解，降低得率。有機(jī)溶劑熱回流提取法， 是目前國內(nèi)外使用最廣泛的提取方法，常用的有機(jī)溶劑有乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等；某 些強(qiáng)極性酚酸（苯甲酸，肉桂酸等）不能完全用純有機(jī)溶劑提取，采用乙醇-水配比混合 液提取效果更佳；二氯甲烷、氯仿、正己烷等某些極性較小的溶劑適用于非極性化合物的提 取，如蠟、留醇、葉綠素等。一定濃度的乙醇或甲醇水溶液最常用于黃酮類化合物的提取，高 濃度的醇溶液（90%以上）適宜于提取苷元，低濃度的醇溶液則適宜于提取苷類。微波輔 助萃取法，是利用不同的物質(zhì)在微波場中吸收微波能力的差異，待提取物中某些組分首先 被選擇性加熱，與體系分離后進(jìn)入介電常數(shù)小、微波吸收能力相對差的提取劑，具有高選擇 性、后處理方便、對環(huán)境安全無害等特點(diǎn)。超聲波提取法是利用超聲波空化作用，加速植物 有效成分浸出的過程，具有高效、快速、操作簡單等特點(diǎn)。超臨界流體萃取主要是利用超臨 界流體的特性進(jìn)行分離，超臨界流體既有對溶質(zhì)溶解度大的特征，又有氣體易于分散和運(yùn) 動(dòng)的特點(diǎn)；當(dāng)處于臨界狀態(tài)時(shí)，溫度和壓力的微小改變，引起超臨界流體密度的顯著變化， 從而使其溶解能力也發(fā)生相應(yīng)變化，一般常選用〇) 2作為超臨界流體，萃取植物中的有效成 分。超臨界流體萃取提取效率高，活性組分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解，能耗低，不產(chǎn)生任 何新的"三廢"物質(zhì)，對環(huán)境保護(hù)有利。研宄人員利用超臨界CO2萃取技術(shù)從藤茶莖中萃取 黃酮類和酚類物質(zhì)，并對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；還考察了藤茶莖提取物對DPPH自由基清除能 力和與亞鐵離子的螯合作用，結(jié)果表明，提取物對DPPH自由基表現(xiàn)出極強(qiáng)的清除能力，但 與亞鐵離子的螯合作用卻很弱，此外，利用HPLC技術(shù)從提取物中檢測到文獻(xiàn)中未報(bào)道過 的一些黃酮類化合物，包括芹菜素，牡荊苷，木犀草素等。
[0004] 在實(shí)際生產(chǎn)過程中，常用大型設(shè)備對竹葉進(jìn)行熱回流提取，提取效率雖不及超聲 波提取、微波輔助萃取和超臨界流體萃取的效果高，但熱回流提取生產(chǎn)成本低，易于操作， 適用于大批量工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中涉及的純化方法主要有大孔樹脂吸附法、柱層析、紙層析法、膜分離、 重結(jié)晶等。大孔樹脂是一類具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子聚合物吸附劑，其原理是通過范德華引 力或氫鍵作用實(shí)現(xiàn)對黃酮類化合物的吸附，此外，由于惰性致孔劑除去后殘留的多孔性結(jié) 構(gòu)也起到分子篩的作用。大孔樹脂具有吸附選擇性好、解吸條件溫和、使用周期長、再生簡 便等優(yōu)點(diǎn)，并且提取率較高、成本費(fèi)用低，適合在制備分離工藝中應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的 分離純化?？导覄俚葴y定了 7種大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附與解吸過程，其中AB-8大孔 樹脂表現(xiàn)出良好的吸附和解吸性能。聚酰胺樹脂通過分子中的酚羥基與樹脂中的酰胺基 基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵作用來實(shí)現(xiàn)吸附過程，其吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類化合物分子中的羥基數(shù) 目、位置以及洗脫劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。聚酰胺樹 脂對黃酮類化合物有很好的富集作用，適于黃酮類化合物的大量制備分離工藝。劉會利用 聚酰胺樹脂對淡竹葉中黃酮類成分進(jìn)行純化，得到最佳工藝，收集70%乙醇洗脫液得淡竹 葉總黃酮，其含量達(dá)36%。硅膠柱層析，主要用于分離弱極性的黃酮類化合物，如異黃酮、二 氫黃酮（醇）和高度甲基化或乙?；狞S酮和黃酮醇，純化過程中經(jīng)常選用混合溶劑進(jìn)行 梯度洗脫，氯仿_甲醇、石油醚-丙酮等都是常用的溶劑洗脫組合。膜分離技術(shù)，是在外界 施加壓力時(shí)，提取液通過濾膜時(shí)，高分子被截留的分離技術(shù)，可有效去除大分子物質(zhì)，如蛋 白質(zhì)、多糖、大分子色素等。在分離過程中，無相變化，且提高了藥液澄清度，有效成分含量 也得到很大提高，可實(shí)現(xiàn)選擇性分離。唐浩國等通過對5種超濾膜的對比研宄，選擇切割分 子量為50000D的聚砜膜PSF-500對麻竹竹葉黃酮進(jìn)行純化效果更佳，產(chǎn)品得率達(dá)4. 29%。 高紅寧等也通過陶瓷膜與醇沉的分離效果對比，結(jié)果表明微濾結(jié)合大孔樹脂純化技術(shù)對苦 參水提液中總黃酮處理的吸附率及除雜效果更佳。紙層析和重結(jié)晶工藝在文獻(xiàn)中也有涉 及，但均存在不同程度的缺點(diǎn)而限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 現(xiàn)今，也有很多專利報(bào)道過竹葉黃酮的純化方法，郭雪峰等得到至少50%的總黃 酮，專利采用乙醇提取，石油醚或乙醚去脂處理，大孔樹脂柱分離，超濾膜和納濾膜截留大 分子物質(zhì)，最后得竹葉黃酮粗提物。王成章等采用HPLC法從30種竹葉中篩選黃酮含量高 的竹種作為生產(chǎn)原料，Ci?C3醇提取，濃縮，陶瓷膜、超濾膜和納濾膜過濾，再經(jīng)大孔樹脂純 化后得黃酮含量達(dá)40%?65%竹葉黃酮提取物。
[0007] 隨著竹葉黃酮成分的明確，其應(yīng)用價(jià)值也得到學(xué)者們的關(guān)注，主要應(yīng)用在食品，醫(yī) 藥保健，化妝品等行業(yè)。通過對國家發(fā)明專利的搜索，已有諸多專利對黃酮有效成分加以提 取并利用。張英將適量竹葉黃酮添加到啤酒中，生產(chǎn)出竹啤飲料，不僅保留了啤酒的營養(yǎng)價(jià) 值和口味，還具有促進(jìn)身體微循環(huán)，降低血脂等多重保健功能，同時(shí)帶有典型的竹子清香。 也有用竹葉黃酮開發(fā)血栓性疾病預(yù)防或治療的藥物或保健品。此外，胡林福和陳永健結(jié)合 膜處理工藝，將竹葉黃酮用于飼料添加劑，保健食品原料，食品添加劑，醫(yī)藥中間體和化妝 品原料的收集，這些產(chǎn)品具有提取率高、工藝流程簡單、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)。劉志河和李偉 試圖將竹葉黃酮類物質(zhì)加入口腔清潔護(hù)理產(chǎn)品中，不但可去除異味，還具有消炎抑菌，防治 口腔疾病之功效，此外對口腔中的潰瘍面有一定的修復(fù)作用。可見竹葉黃酮對人類健康具 有十分重要的作用。
[0008] 竹葉在我國具有悠久的食用和藥用歷史，近年來對竹葉資源化學(xué)利用的研宄也在 逐年增多，但在竹葉提取物方面的研宄依舊有不足之處，需要進(jìn)一步深入研宄。
[0009] 目前，以竹葉四種黃酮碳苷（葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷）為對象進(jìn)行 的提取純化工藝的優(yōu)化還比較少，純度相對較低，還沒有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對目前存在的問題，本發(fā)明提供一種毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝， 以毛竹為研宄對象，以四種黃酮碳苷的得率為指標(biāo)，對毛竹葉四種黃酮碳苷提取和純化工 藝進(jìn)行優(yōu)化，使得在優(yōu)化條件下，四種黃酮碳苷的提取率和純度都最高，可以用作醫(yī)藥中間 體或功能性保健食品開發(fā)的原料，為實(shí)現(xiàn)黃酮碳苷的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：
[0012] 毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝，所述的四種黃酮碳苷為葒草苷、異葒草 苷、牡荊苷和異牡荊苷，包括如下步驟：
[0013] (1)準(zhǔn)確稱取毛竹葉粉末，加入乙醇水溶液中進(jìn)行熱回流提取，重復(fù)提取4次， 過濾并將濾液合并得提取液；所述熱回流提取的工藝為：70%?80%的乙醇，料液比為 1 : 15?1 : 25,60?80°〇恒溫水浴提取1?311;
[0014] (2)采用減壓蒸餾法除去提取液中的有機(jī)溶劑，加入與提取液等體積的石油醚萃 取，除去色素和脂溶性成分，重復(fù)萃取三次，得到毛竹葉黃酮粗提物，石油醚回收，循環(huán)使 用；
[0015] (3)經(jīng)聚酰胺樹脂再次進(jìn)行純化處理：將毛竹葉黃酮粗提物經(jīng)大孔樹脂進(jìn)行純化 處理：大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，將毛竹葉黃酮粗提物上大孔樹脂柱，濕法裝柱，加入IOmg 竹葉黃酮粗提液，控制流速3BV*h'大孔樹脂與樣品上樣量比為5 : 1，收集樣品流出液， 流出液重復(fù)上柱3次后，用15 %乙醇溶液以4BV?IT1的流速初步洗脫除雜，濃縮洗脫液， 然后用60 %的乙醇溶液以4BV?IT1流速洗脫，最后收集60 %乙醇洗脫液，濃縮并冷凍干燥 得純化后毛竹葉黃酮干粉；
[0016] (4)將上述大孔樹脂純化后的竹葉黃酮粉末，溶解后，將聚酰胺樹脂濕法裝柱于 2cmX35cm層析柱中，裝柱高度為12. 5cm，加入IOmg?ml/1上述竹葉黃酮干粉配制的溶液， 控制3BV 流速過柱，收集流出液，重復(fù)上柱3次，再用蒸餾水洗脫，收集洗脫液，濃縮，接 著用等體積40%乙醇溶液洗脫，最后收集40 %乙醇洗脫液，濃縮并冷凍干燥得純化后的竹 葉黃酮干粉。
[0017] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，經(jīng)過試驗(yàn)篩選，所述熱回流提取 的工藝優(yōu)選為：75%乙醇、料液比I: 20、70°C下恒溫水浴提取2h。
[0018] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，所述的大孔樹脂為ADS-17、DM130 或D101，優(yōu)選為D101。
[0019] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，所述聚酰胺樹脂的粒徑為 0. 15 ?0. 25mm。
[0020] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，在經(jīng)大孔樹脂或聚酰胺樹脂進(jìn)行 純化處理前，對大孔樹脂或聚酰胺樹脂進(jìn)行預(yù)處理，具體如下：
[0021] 用無水乙醇洗去細(xì)小樹脂及雜質(zhì)，然后