計算 出0??-4活性在反應體系11111換算時的50%抑制濃度（1(： 5(|值）。
[0129] (實施例5)
[0130] 用pH4. 8的0. 1M醋酸鈉緩沖液制備來自牛的明膠5質量％溶液。在該溶液中加 入與制造例1同樣新制備的生姜根莖有機溶劑干燥粉碎物，相對于來自牛的明膠以質量換 算為1/10倍量，以成為〇. 2w/v%的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物（谷胱甘肽含有率為 15%以上），邊以50°C振蕩、攪拌邊使其反應16h。將得到的反應液過濾后，回收濾液，獲得 肽溶液。對該溶液滅菌處理后，用噴霧干燥器干燥，得到肽粉末。
[0131] 對將得到的肽粉末給藥的情況下血糖值的變動進行評價。
[0132] (1)將25只8周齡C57BL/6J雄性小鼠馴化飼養(yǎng)一周（日本Charles River)。糖 負荷試驗前7天期間對各鼠給予0. 25ml蒸餾水，馴化成口服給藥。
[0133] (2)從糖負荷試驗的前一天16點起使其除水以外斷食18小時。測定空腹時血糖 值，以空腹時血糖值相等的方式分成5組（n = 5)。五組由陽性對照組、膠原肽組合物給藥 組（400mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg)、陰性對照組構成。
[0134] (i)對陽性對照組：在給予20w/v%糖水溶液1小時前，以3mg/kg將西他列?。∕SD 公司制，捷諾維）口服給藥。
[0135] (ii)對膠原肽組合物給藥組：在給予藥葡萄糖15分鐘前，將上述肽粉末溶解在蒸 餾水中以給藥量為400mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg的方式口服給藥。
[0136] (iii)陰性對照組：在給予糖15分鐘前，以20ml/kg 口服給予蒸餾水。
[0137] (3)給予糖。在給予糖時，以10ml/kg給予20w/v%糖水溶液。
[0138] (4)給予葡萄糖后，在15、30、60、120分鐘從尾部采血，用簡易血糖測定器（Arkray Factory制，GT-164)測定血糖值。將結果示于圖3。此外，組間統(tǒng)計學上的顯著性差異用 Aspin-Welch的t檢驗。在圖3中，*表示相對于蒸餾水給藥組P < 0. 05的顯著性差異，** 表示相對于蒸餾水給藥組P < 〇. 01的顯著性差異。
[0139] (5)在測定血糖時用肝素采血管進行25 yl的采血，使用ELISA試劑盒（Lbis Insulin-Mouse-U型）測定胰島素的濃度。將結果示于圖4。組間統(tǒng)計學上的顯著性差異 用Aspin-Welch的t檢驗。在圖4中，*表示相對于蒸餾水給藥組P < 0. 05的顯著性差異， **表示相對于蒸餾水給藥組P < 0. 01的顯著性差異。
[0140] 如圖3所示，給予注射用水的陰性對照組中，從給予糖前為血糖值60mg/dL升高到 在給予糖15分鐘后為440mg/dL，在給予糖30分鐘為380mg/dL，在60分鐘后為280mg/dL 逐漸減少。而陽性對照組中，在給予糖15分鐘后升高到220mg/dL，但在給藥后以30分鐘? 120分鐘半衰到125?150mg/dL，并維持該值。
[0141] 而膠原肽組合物給藥組中，1000mg/kg給藥組和2000mg/kg給藥組在給予糖15分 鐘后均為250mg/dL，顯示出了與陰性對照組顯著性低的血糖值。其后，給藥30分鐘時為 220?250mg/dL、給藥120分鐘時為250?280mg/dL，完全沒有觀察到血糖值的劇烈變化。 但是，400mg/kg的給藥組顯示出了與陰性對照組大致相同的血糖值的推移。
[0142] 如圖4所示，對于膠原肽組合物給藥組，與陰性對照組相比，血中胰島素濃度升 高。由此，推斷出血糖值升高抑制效果的一部分是促進胰島素分泌和抑制分解。另一方面， 與陽性對照組相比，其作用溫和，沒有得到藥劑程度的效果。
[0143] (實施例6)
[0144] 將與實施例5同樣新制備的肽粉末對9位健康正常人給藥，觀察對飯后血糖值的 作用。
[0145] (1)飲用溶解有25g肽粉末的水100ml、或作為對照的水100ml。在飲用肽粉末后 經(jīng)過30分鐘后，飲用Trelan G液75g(味之素制藥株式會社制，含葡萄糖75克）225ml。飲 用75g的Trelan G液后，測定30分鐘后、60分鐘后、120分鐘后的血糖值。在1周后，更換 水和肽粉末進行同樣的糖負荷試驗。將結果示于圖5。此外，組間統(tǒng)計學上的顯著性差異使 用Tukey-Kramer test。在圖5中，*表不對于蒸餾水給藥組P < 0. 05的顯著性差異。
[0146] (2)計算出上述（1)的血糖值到120分鐘后的累積值（AUC)。將結果示于圖6。此 夕卜，組間統(tǒng)計學上的顯著性差異使用Tukey-Kramer test。在圖5中，*表示對于蒸餾水給 藥組P< 0.01的顯著性差異。
[0147] 如圖5所示，如果對健康正常人口服攝取由本發(fā)明的制造方法得到的膠原肽組合 物，則統(tǒng)計學上顯著性地抑制了在攝取葡萄糖60分鐘中的飯后血糖值升高。顯示出了葡萄 糖攝取120分鐘的飯后血糖值進一步降低，抑制葡萄糖攝取后血糖值的劇烈變化。同樣地 如圖6所示，血糖值到120分鐘后的累積值與對照組相比，顯示出了統(tǒng)計學上顯著性低值。
[0148] (比較例）
[0149] 制備含有2mM氯化鈣、來自牛的明膠5質量％溶液，用1M碳酸鈉調(diào)節(jié)至pH7. 8。以 成為0. lw/v%的方式在該溶液中添加來自梭菌屬的膠原酶（羅氏公司制，Liberase C/T)， 邊以30°C振蕩、攪拌邊使其反應20h，在沸水中加熱5分鐘停止酶反應，得到肽溶液。將該 肽溶液在與實施例1同樣的LC/MS測定條件下分離，對構成其的寡肽的含量進行定量。將 寡肽的含量示于表5。另外，用得到的肽溶液與實施例4同樣地進行操作測定IC 5(I值，IC5Q 值為 〇? 21mg/ml。
[0150] 如表5所示，使用來自梭菌屬的膠原酶的情況，沒有生成以X-Hyp-Gly (式中，X表 示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸殘基）表示的肽。
[0151] (參考例）
[0152] 對于實施例1中得到的肽溶液含有的寡肽的一部分，與實施例4同樣地測定IC5(I 值。將結果不于表6。
[0153] 如表6所示，以X-Hyp-Gly (式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸殘基） 表示的肽包含對于DPP-4阻礙活性的IC5(I值低的肽。另外，膠原肽組合物含有的肽也包含 針對DPP-4阻礙活性的IC 5(I值低的肽。
[0154] [表 1]
[0155] (mg/g)
【主權項】
1. 一種膠原膚組合物的制造方法，其特征在于，在膠原和/或明膠溶液中添加來自生 姜根莖的酶進行分解，生成含有WX-Hyp-Gly表示的膚的膚組合物，X-Pro-Gly式中，X表示 除Gly、Hyp和Pro W外的氨基酸殘基。
2. 根據(jù)權利要求1所述的膠原膚組合物的制造方法，其特征在于，將生姜根莖的干燥 粉碎物用作所述來自生姜根莖的酶。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的膠原膚組合物的制造方法，其特征在于，將含有谷脫甘 膚的酵母與所述來自生姜根莖的酶一同W 0. 005?0. 5w/v%的范圍添加，和/或調(diào)節(jié)到 pH4. 0?6. 0的范圍使其反應。
4. 根據(jù)權利要求1?3中任一項所述的膠原膚組合物的制造方法，其特征在于，所述膚 組合物所含的W所述式表示的膚的含量是在所述膠原和/或明膠的0. 01摩爾％ W上。
5. 根據(jù)權利要求1?4中任一項所述的膠原膚組合物的制造方法，其特征在于，進一 步含有W X-Pro-Gly表示的膚，X-Pro-Gly式中，X表示除Gly、Hyp和Pro W外的氨基酸殘 基。
6. -種DPP-4阻礙劑，其特征在于，含有由權利要求1?5中任一項所述的制造方法得 到的膠原膚組合物。
7. -種血糖值升高抑制劑，其特征在于，含有由權利要求1?5中任一項所述的制造方 法得到的膠原膚組合物。
【專利摘要】本發(fā)明提供新的膠原肽組合物的制造方法、和含有所述膠原肽組合物的DPP-4阻礙劑、血糖值升高抑制劑。在膠原和/或明膠溶液中添加來自生姜根莖的酶進行分解，生成含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸殘基)表示的肽的肽組合物。這樣得到的膠原肽組合物DPP-4阻礙活性高，且血糖值升高抑制效果優(yōu)異。
【IPC分類】C12N9-99, A61K38-17, A61P43-00, A61P3-10, C12P21-06, C07K14-78
【公開號】CN104540960
【申請?zhí)枴緾N201380039779
【發(fā)明人】多賀祐喜, 楠畑雅, 鈴木哲, 林田治, 小山洋一, 服部俊治
【申請人】株式會社日皮
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2013年7月23日
【公告號】CA2880009A1, US20150182580, WO2014017474A1