膠原肽組合物的制造方法、dpp-4阻礙劑和血糖值升高抑制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及膠原肽組合物的制造方法、含有所述膠原肽組合物的二肽基肽酶4阻 礙劑（以下簡稱為DPP-4阻礙劑）和血糖值升高抑制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，從膠原、明膠的水解物中發(fā)現(xiàn)大量的活性肽。作為活性肽的用途，有以 Hyp-Gly為關(guān)節(jié)炎、褥瘡抑制劑（專利文獻1)、以Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ala-Hyp-Gly為明膠合 成促進劑（專利文獻2)、以Gly-X-Y-(Gly-Z-W)表示的肽為血糖值升高抑制劑（專利文獻 3)、以Gly-Pro-Ala-Gly為DPP-4阻礙劑（專利文獻4)、以Pro-Hyp的成纖維細胞增殖促進 作用為化妝品（專利文獻5)等大量的報告。另外，關(guān)于口服攝取了膠原、明膠時的消化、吸 收、代謝，報告了 Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro_Hyp-Gly 等二肽、三肽在血 中存在（非專利文獻1)、Hyp_Gly在血中存在（非專利文獻2)。由于這些肽具有生理活性 (專利文獻1、專利文獻2、專利文獻5)，因此，二肽、三肽在血中轉(zhuǎn)移被認為是膠原在口服攝 取中的機制之一。水解膠原、明膠的蛋白質(zhì)分解酶數(shù)量眾多，為了通過其中的任何一個、或 它們的組合來有效地生成生理活性肽而進行研宄，蛋白質(zhì)分解酶的選擇成為重要的因素之 〇
[0003] 膠原具有甘氨酸每三個殘基便重復(fù)、以所謂被稱作膠原樣序列的_(Gly_氨基酸 X-氨基酸Y)n_表示的特征性氨基酸序列，作為每到該單元便分解的蛋白質(zhì)分解酶，具有細 菌膠原酶。使用細菌膠原酶進行分解的方法是得到Gly-X-Y型肽的優(yōu)異方法。作為關(guān)于由 細菌膠原酶生成的肽的生理活性的報告，有使用所述以Gly-X-Y-(Gly-Z-W)表示的肽的血 糖值升高抑制劑（專利文獻3)、使用Gly-Ala-Arg等三肽的膠原生成促進劑（專利文獻6) 等。
[0004] 另一方面，也有使多個蛋白質(zhì)分解酶組合地以多個階段進行反應(yīng)來獲得所需要的 肽的方法。例如有為了制造含有L-脯氨?；?L-羥基脯氨酸的組合物，首先用具有膠原酶 活性的蛋白酶進行處理，接著使肽鏈端解酶作用的方法（專利文獻7)。另外，也有為了得到 Glu-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly、Ser-Hyp_Gly，在1次酶處理中使來自膠原酶、黃曲霉的蛋白酶 作用，接著作為2次酶處理，在從N末端起第2個存在除脯氨酸或羥基脯氨酸以外的氨基酸 的情況下使氨基酸從N末端起游離的肽酶作用，從而生成1次酶處理物不含有的肽的方法 (專利文獻8)。
[0005] 另一方面，下述公知的：生姜中含有生姜蛋白酶（Zingibain)(非專利文獻3);膠 原也可被除細菌膠原酶等以外的生姜蛋白酶分解（非專利文獻4);以及從將生姜根莖在極 性溶劑中粉碎、干燥該過濾殘渣而成的粉末中提取的酶的蛋白酶活性比直接從生姜根莖中 提取的酶的蛋白酶活性高。
[0006] 并且已知：生姜蛋白酶是脯氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，在從N末端側(cè)讀取時，切 斷與Pro的C末端側(cè)相鄰的氨基酸殘基與下一個氨基酸殘基之間的肽鍵（專利文獻9)。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1 :日本特開2010-106003號公報
[0010] 專利文獻2 :日本特開2010-24200號公報
[0011] 專利文獻3 :國際公開第2008/66070號
[0012] 專利文獻4 :國際公開第2013/65832號
[0013] 專利文獻5 :日本特開2007-1981號公報
[0014] 專利文獻6 :日本特開2003-137807號公報
[0015] 專利文獻7 :日本特開2012-135222號公報
[0016] 專利文獻8 :國際公開第2012/102308號
[0017] 專利文獻9 :日本特表2007-522822號公報
[0018] 非專利文獻
[0019] 非專利文獻 1 :J.Agric.FoodChem. 2005Aug10 ;53 (16) : 6531-6536.
[0020] 非專利文獻 2:FoodChemistry1291019-10242011.
[0021] 非專利文獻3 :生姜蛋白分解酶的分離純化、營養(yǎng)與糧食，1973年，26卷6 號，P377-383.
[0022] 非專利文獻4:Plantcollagenase:uniquecollagenolyticactivityof cysteineproteasesfromginger,BiochimBiophysActa，2007 年，1770 卷 12 號，P1627-1635.
[0023] 非專利文獻5:Preparationofproteolyticactivityrichgingerpowderand evaluationofitstenderizingeffectonspent-henmuscles,JournalofMuscle Foods，2006 年，17 卷 2 號，pl74-184.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 發(fā)明要解決的問題
[0025] 在以X表示氨基酸殘基的情況下，以X-Hyp-Gly表示的三肽中存在具有特有的生 理活性的肽。所述專利文獻2中，記載有Ala-Hyp-Gly具有膠原合成促進作用并可在生物 體膠原合成促進用化妝品、皮膚治療藥等中使用。另外，所述專利文獻8中稱Glu-Hyp-Gly、 Leu-Hyp-Gly等具有DPP-4阻礙活性。然而，以X-Hyp-Gly表示的肽不能僅通過細菌膠原酶 分解膠原蛋白、明膠而生成。這是因為：細菌膠原酶在Gly的N末端側(cè)切斷因而切斷上述式 的Hyp與Gly之間的肽鍵。所以，所述專利文獻2中通過人工合成生成Ala-Hyp-Gly，所述 專利文獻8中使用多個酶以2階段反應(yīng)生成。然而，在工業(yè)生產(chǎn)中，人工合成、將多個酶組 合成為工序數(shù)變多、成本高的一個原因。因此，期望開發(fā)出可高效地分解膠原、明膠并生成 以X-Hyp-Gly表示的三肽的膠原肽組合物的制造方法。
[0026]通常，口服攝取的蛋白質(zhì)、肽被消化道酶分解成氨基酸、二肽、三肽，從小腸上皮通 過氨基酸轉(zhuǎn)運子、肽轉(zhuǎn)運子攝入到血液中。如前所述，二肽、三肽在血中較穩(wěn)定地存在且存 在具有生理活性的二肽、三肽。通過生姜蛋白酶，可生成含有脯氨酸殘基的肽，但其種類多， 關(guān)于其生理活性的研宄正在進行。如果發(fā)現(xiàn)新的藥效，就能夠有效地利用由簡單的方法獲 得的肽。
[0027] 鑒于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于，提供以膠原和/或明膠作為原料、可高效地制 造以X-Hyp-Gly表示的三肽的膠原肽組合物的制造方法。
[0028] 另外，本發(fā)明的目的還在于，提供基于上述膠原肽組合物的生理活性的DPP-4阻 礙劑和血糖值升高抑制劑。
[0029] 用于解決課題的方法
[0030] 本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)如果在膠原和/或明膠溶液中添加來自生姜根莖的酶，則從C 末端起第2個的氨基酸殘基能夠產(chǎn)生Hyp的膠原肽；在獲得的膠原肽組合物中含有以 X-Hyp-Gly表示的肽，并且也同時生成以X-Pro-Gly表示的肽等；獲得的膠原肽組合物的 DPP-4阻礙活性高；如果將其對動物口服給藥，則具有降血糖的效果，從而完成了本發(fā)明。
[0031] 即，本發(fā)明提供膠原肽組合物的制造方法，其特征在于，在膠原和/或明膠溶液中 添加來自生姜根莖的酶進行分解，生成含有以X-Hyp-Gly (式中，X表示除Gly、Hyp和Pro 以外的氨基酸殘基）表示的肽的肽組合物。
[0032] 另外，本發(fā)明提供上述膠原肽組合物的制造方法，其特征在于，將生姜根莖的干燥 粉碎物用作所述來自生姜根莖的酶。
[0033] 另外，本發(fā)明提供上述膠原肽組合物的制造方法，其特征在于，將含有谷胱甘肽 的酵母與所述來自生姜根莖的酶一同以〇. 005?0. 5w/v%的范圍添加，和/或調(diào)節(jié)到 pH4. 0?6. 0的范圍使其反應(yīng)。
[0034] 另外，本發(fā)明提供上述膠原肽組合物的制造方法，其特征在于，所述肽組合物所含 的以所述式表示的肽的含量是所述膠原和/或明膠的〇. 01摩爾％以上。
[0035] 另外，本發(fā)明提供膠原肽組合物的制造方法，其特征在于，進一步含有以 X-Pr〇-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸殘基）表示的肽。
[0036] 另外，本發(fā)明提供含有由上述制造方法得到的膠原肽組合物的DPP-4阻礙劑。
[0037] 另外，本發(fā)明提供含有由上述制造方法得到的膠原肽組合物的血糖值升高抑制 劑。
[0038] 發(fā)明的效果
[0039] 根據(jù)本發(fā)明，能夠通過在膠原、明膠溶液中添加來自生姜根莖的酶來以1階段的 酶反應(yīng)制造含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸殘基）表示的 肽的膠原肽組合物。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)⒂伤鲋圃旆椒ǐ@得的膠原肽組合物用于DPP-4阻礙劑和血 糖值升高抑制