專利名稱:細(xì)胞色素p450 bm-3變體酶及其編碼基因和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種變體酶，尤其涉及ー種細(xì)胞色素P450 BM-3變體酶及其編碼基因和用途。
背景技術(shù)：
靛藍(lán)是ー種具有悠久歷史的天然染料，無論是古埃及木乃伊穿著的ー些服裝，還是我國馬王堆漢墓出土的藍(lán)色麻織物，它們的顔色都來自靛藍(lán)。靛藍(lán)之所以得到人們長期、廣泛的青睞，最關(guān)鍵的一點在于它具有其它染料無法比擬的染著牢固度和耐光堅牢度，因此，靛藍(lán)也被稱為“染料之王”。
在遠(yuǎn)古時代，靛藍(lán)主要從含有靛藍(lán)的植物(如菘藍(lán)、寥藍(lán)、木藍(lán)等)中獲得。到了19世紀(jì)中葉，由于天然靛藍(lán)的生產(chǎn)無法滿足紡織エ業(yè)迅猛發(fā)展的需求，人們開始嘗試采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)。1897年，德國巴斯夫生產(chǎn)的合成靛藍(lán)問世，并以生產(chǎn)簡便、原料充足、純 度高、易貯運、使用方便等優(yōu)點，得以迅速普及，最終使得應(yīng)用了幾千年歷史的植物靛藍(lán)黯然失色，于20世紀(jì)60年代退出了歷史舞臺。20世紀(jì)80年代后，隨著社會文明程度的提高和環(huán)保意識的增強(qiáng)，天然靛藍(lán)重新獲得了人們的關(guān)注和重視。
采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)吋，需要使用對呼吸道、中樞神經(jīng)及肝臟均有毒害、可導(dǎo)致人體中毒的苯胺和鄰苯ニ甲酸酐。這不僅影響了所合成的靛藍(lán)的安全性，而且也對環(huán)境具有污染。由于而今不可能再大量種植與糧食作物爭地的產(chǎn)靛藍(lán)植物，人們把生產(chǎn)天然靛藍(lán)的希望寄托于靛藍(lán)的生物制備技術(shù)，試圖通過那些能催化吲哚轉(zhuǎn)化為靛藍(lán)的生物催化劑實現(xiàn)靛藍(lán)的緑色制備。利用生物催化劑進(jìn)行靛藍(lán)的生物制備具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)條件溫和、能耗低、產(chǎn)生的有害廢物少、產(chǎn)品安全等優(yōu)點，對保護(hù)環(huán)境、維持生態(tài)平衡等具有明顯優(yōu)勢，所以，生物法生產(chǎn)靛藍(lán)取代靛藍(lán)的化學(xué)合成得到了很多研究者的認(rèn)同和重視。
目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列能催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的生物催化劑，其中最受關(guān)注的是一種細(xì)胞色素P450BM-3酶。在P450酶系中，細(xì)胞色素P450BM-3酶是從巨大芽孢桿菌(B. megaterium)中發(fā)現(xiàn)的具有中長鏈脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和分子氧的存在條件下，可以迅速催化鏈長為C12 C18的飽和脂肪酸末位羥基化，將單個氧插入到不活潑的碳?xì)滏I中。
2000年，德國斯圖加特大學(xué)技術(shù)生化研究所R. D. Schmid領(lǐng)導(dǎo)的科研小組，通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得了具有三個突變位點、能夠催化吲哚生成靛藍(lán)的細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶，這使細(xì)胞色素P450BM-3酶第一次獲得了催化靛藍(lán)產(chǎn)生的能力(“Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into anindo I e-hydroxy lating catalyst，，Chemi stry-A European Journal, LiQ S, SchwanebergU，F(xiàn)ischer P，Schmid R D. 2000,6 :1531 1536)。但是，該變體酶催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的活カ還較低，因此有必要通過進(jìn)一歩的蛋白質(zhì)改造，提高細(xì)胞色素P450BM-3酶對吲哚的親和力和催化活力，提高靛藍(lán)生物制備的效率。
公開號分別為“CN1900285A”、“CN 1900286A”、“CN 1900287A”的中國專利公開了三種細(xì)胞色素P450BM-3酶的變體基因，該三種變體基因分別將第168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榻M氨酸的密碼子、將168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榱涟彼岬拿艽a子、將435位谷氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子，該三種變體基因編碼的細(xì)胞色素P450BM-3酶與底物親和能力較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，解決了現(xiàn)有變體酶與底物親和カ較小，熱穩(wěn)定性差，催化吲哚生成靛藍(lán)的效率較低的問題。
一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，命名為細(xì)胞色素 P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)變體酶或細(xì)胞色素P450BM-3(D168L/E435T/V445A)。
本發(fā)明通過定點突變，在細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶的基礎(chǔ)上引入了三個突變位點，即168位點由天冬氨酸⑶突變?yōu)榱涟彼?L)，435位點由谷氨酸(E) 突變?yōu)樘K氨酸(T)，445位點由纈氨酸(V)突變?yōu)楸彼?A)，該突變位置序號為蛋白不包括起始密碼子編碼氨基酸的順序號。
本發(fā)明還提供了一種編碼所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的基因，其堿基序列如SEQ ID NO. 2 所示。
該基因通過如下方法獲得
首先，本發(fā)明根據(jù)細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基因的血紅素域部分設(shè)計兩對定點突變引物，以質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，用Dpn I消化模板質(zhì)粒，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)BL21中，篩選獲得突變體。
抽取質(zhì)粒，經(jīng)測序可知，突變酶P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)基因上的編碼第168位氨基酸的堿基序列由“GAT”突變?yōu)椤癈TG”，編碼第435位氨基酸的堿基序列由“GAA”突變?yōu)?“ACG”，同時該質(zhì)粒命名為質(zhì)粒 pET-28a(+) -P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)。
接著，同樣根據(jù)細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶基因的血紅素域部分設(shè)計飽和定點突變引物，以質(zhì)粒 pET-28a(+) -P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，用用Dpn I消化模板質(zhì)粒。
將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E. coli)BL21中，篩選獲得突變體，抽取質(zhì)粒，經(jīng)測序可知，其中一個突變體基因編碼第445位氨基酸的堿基序列由“ GTG ”突變“GCG”。
本發(fā)明又提供了包含所述基因的表達(dá)盒、重組載體以及轉(zhuǎn)化子。
所述重組載體的原始載體為pET-28a、、pET-29、pET-30、pET-34 或 pRSET。
所述轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E. coli)BL21、大腸桿菌(E. coli)BLR、大腸桿菌(E. coli)Origami、大腸桿菌(E. coli)NovaBlue 或大腸桿菌(E. coli)Rosetta。
本發(fā)明提供了所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶在催化吲哚轉(zhuǎn)化生成靛藍(lán)中的應(yīng)用。
本發(fā)明所獲得的變體酶的酶學(xué)參數(shù)較父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶有顯著改善，轉(zhuǎn)化數(shù)(Keat)相對父本提高了 2. 6倍，催化效率(Keat/KM)是父本的I. 5倍；與細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶相比，增加更為顯著，轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)是其18. 4倍，催化效率(KMt/KM)是其13. O倍；說明本發(fā)明變體酶對底物吲哚具有更高的催化活力。
具體實施方式
一、質(zhì)粒 pET-28a (+) -P450BM-3 (F87V/A74G/L 188Q)
本發(fā)明所使用的質(zhì)粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)由德國斯圖加特大學(xué)R. D. Schmid教授惠贈，它是將細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶基因插入原始載體pET-28a (+)的啟動子下游制得，其中突變基因的序列和重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)已記載在中國專利 00810943. 5、中國專利 200610052588. 0 和文獻(xiàn)(“Directed Evolution ofthe Fatty-Acid Hydroxylase P450 BM-3 into an Indole-Hydroxylating Catalyst.Chemistry-A European Journal. 2000,6 (9) :153ト 1536”)中。重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法可以參考現(xiàn)有的一般質(zhì)粒構(gòu)建方法。利用該質(zhì)粒的目的是為了得到細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/ A74G/L188Q)變體酶基因，對載體無特異性要求。
ニ、定點突變PCR引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得
根據(jù)細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)基因的血紅素域部分設(shè)計如下兩對定點突變引物，分別在基因第168位點引入亮氨酸突變，在第435位定點引入蘇氨酸突變
第一對引物
上游引物5’-TTTTACCGACTGCAGCCTCATCC-3 ’
下游引物5，-GAGGCTGCAGTCGGTAAAAGCTG-3，
第二對引物
上游引物5’-CGAGCTGGATATTAAAACGACTTTAACG-3’
下游引物5，-CGTTAAAGTCGTTTTAATATCCAGCTCG-3，
PCR反應(yīng)體系為50 ill :
即向250 ii I的eppendorf管中加入IOOpmol的dNTPs,各15pmol的上游引物和下游引物，大約2ng的模板質(zhì)粒pET28a+P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)，2. 5U高保真pfu聚合酶，終濃度7mM的MgCl2溶液，Pfu緩沖液5 ill，最后用無菌蒸餾水加至總體積50 yl。
PCR 程序為
95°C預(yù)變性2min后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，即在95°C變性30s，57°C退火30s，72 °C延長5min，共循環(huán)20次，然后72°C延伸5min，得到定點突變PCR產(chǎn)物。
三、突變文庫的構(gòu)建
將上述獲得的定點突變PCR產(chǎn)物，經(jīng)過DpnI消化模板基因，獲得突變基因文庫；將所獲突變基因文庫轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E. coli)BL21化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有50ng/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37°C過夜培養(yǎng)得到相應(yīng)的突變體庫。
四、突變體文庫的篩選及質(zhì)粒測序
從平板上挑取單菌落，接種于5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒，進(jìn)行基因測序。
結(jié)果從待測基因中發(fā)現(xiàn)了一個突變基因，其堿基序列如SEQ ID NO. 4所示，該基因編碼第168位氨基酸殘基的密碼子由編碼天冬氨酸(GAT)突變?yōu)榫幋a亮氨酸(CTT)，第435位氨基酸殘基的密碼子由編碼谷氨酸(GAA)突變?yōu)榫幋a蘇氨酸(ACG)，因此該基因編碼的細(xì)胞色素P450 BM-3酶為五位點突變酶細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
五、五位點突變細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的分離純化
將攜帶有細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶基因的大腸桿菌(E. coli) BL21接種到5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過夜。
取上述過夜培養(yǎng)物接種到IOOml新鮮的含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6 0. 8時，加入終濃度0. 5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，繼續(xù)誘導(dǎo)8小時后結(jié)束誘導(dǎo)。
將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)液于轉(zhuǎn)速為5000rpm離心IOmin,棄去上清,菌體用無菌生理鹽水 洗滌2遍，在冰浴條件下超聲破胞，破胞條件為功率300瓦，3s工作，6s間歇，90個循環(huán)；超聲破胞后的破胞液在轉(zhuǎn)速為15000rpm，溫度為4°C下離心30min，上清即為粗酶液。
粗酶液用金屬螯合親和層析(IMAC)純化,其中金屬螯合介質(zhì)為Ni-NTA介質(zhì),透過的純酶在去除咪唑之后，可以進(jìn)行比活力測定及酶學(xué)參數(shù)的測定。
父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶的制備方法同上，區(qū)別在于采用攜帶質(zhì)粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的大腸桿菌(E. coli)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
六、五位點突變酶催化吲哚生成靛藍(lán)比活力及酶學(xué)參數(shù)的測定
比活力定義為毎分鐘每納摩蛋白催化底物吲哚所得到靛藍(lán)的量，單位為U mol靛藍(lán) /(nmol 蛋白 min)。
測定方法于Iml的IOOmM pH8. 2的Tris-Cl反應(yīng)體系中加入Inmol的純酶、終濃度5mM的吲哚，置于37°C保溫IOmin后，加入0. 4mg NADPH啟動反應(yīng)，反應(yīng)于溫度為37°C水浴，轉(zhuǎn)速為150rpm避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)IOmin后立即取出，迅速加入6M KOH終止反應(yīng)，于分光光度計上測定波長為670nm下的光吸收值即為靛藍(lán)的光吸收情況，井根據(jù)靛藍(lán)摩爾消光系數(shù)e = 3900M^ CnT1計算出靛藍(lán)的濃度。
由此計算出的細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶對靛藍(lán)的比活力為21. 7 ii mo V (nmol ^min)，而細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶對靛藍(lán)的比活力為2.8 ii mo V (nmol min)，故上述變體酶的比活力提高了 7. 0倍。
其他酶學(xué)參數(shù)通過對酶動力學(xué)曲線的測定獲得，反應(yīng)條件為于Iml的IOOmMpH8. 2的Tris-Cl反應(yīng)體系中加入Inmol的純酶、終濃度I 8mM的吲哚，置于37°C保溫lOmin，加入0. 4mg NADPH啟動反應(yīng)，反應(yīng)在溫度為37°C水浴，轉(zhuǎn)速為150rpm避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)IOmin后立即取出，迅速加入6M KOH終止反應(yīng)，于分光光度計上測定波長為670nm處的光吸收值即為靛藍(lán)的光吸收情況，根據(jù)靛藍(lán)摩爾消光系數(shù)e = 3900M—1 ^nT1計算出靛藍(lán)的濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶對靛藍(lán)的Km值為I. 72mM，顯著低于父本酶P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的2. 09mM，表明突變酶對底物具有更高的親和カ；細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶的轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)為28. lSmin—1，是父本(4. (MmirT1)的7. O倍；變體酶的催化效率(Kcat/KM)為16. 37mM_1 mirf1，是父本(I. 93mM_1 mirf1)的 8. 5 倍。
七、飽和突變PCR引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得
根據(jù)細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶基因的血紅素域部分設(shè)計飽和定點突變引物，具體為
上游引物5’ -GGCTTTNNNGTAAAAGCAAAATCG-3 ’，
下游引物5’-TTTTACNNNAAAGCCTTCAGGTTT-3 ’。
PCR反應(yīng)體系為50 ill :
即向250 U I的eppendorf管中加入IOOpmol的dNTPs,各15pmol的上游引物和下游引物，大約 2ng 的模板質(zhì)粒 pET28a(+) -P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)，2. 5U 高保真pfu聚合酶，終濃度7mM的MgCl2溶液，Pfu緩沖液5 U 1，最后用無菌蒸餾水加至總體積50 u I0
PCR 程序為
95°C預(yù)變性2min后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，即在95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延長5min，共循環(huán)20次，然后72°C延伸5min，得到定點飽和突變PCR產(chǎn)物。
ノ V、突變文庫的構(gòu)建
將上述獲得的定點突變PCR產(chǎn)物，經(jīng)過Dpn I消化模板基因，獲得突變基因文庫；將所獲突變基因文庫轉(zhuǎn)化至E. coli BL21化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有50ng/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37°C過夜培養(yǎng)得到相應(yīng)的突變體庫。
九、突變體文庫的篩選及質(zhì)粒測序
從平板上挑取單菌落，用牙簽接菌于每孔裝有Iml LB液體培養(yǎng)基(含有50ng/ml卡那霉素)的96微孔板中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過夜；
取50ul上述過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到一塊新的每孔裝有Iml LB液體培養(yǎng)基(含有50ng/ml卡那霉素)的96微孔板中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)至0D_ =0. 6 0. 8左右，加入終濃度0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)，于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下誘導(dǎo)12小時；
加入終濃度0. 5mM的吲哚，于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下反應(yīng)10小時后，于轉(zhuǎn)速為IOOOOrpm條件下離心I分鐘以收集菌體，用ニ甲基亞砜萃取菌體上的色素，在分光光度計上測定波長為670nm處的光吸收值，即靛藍(lán)的光吸收情況，挑選吸收值大于父本的菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。
結(jié)果從待測基因中發(fā)現(xiàn)了一個突變基因，堿基序列如SEQ ID NO. 2所示，該基因編碼第445位氨基酸殘基的密碼子由編碼纈氨酸(GTT)突變?yōu)榫幋a丙氨酸(GCG)，因此該基因編碼的細(xì)胞色素P450BM-3酶為六位點突變酶細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)變體酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
十、六位點突變細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的分離純化
將攜帶有細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)酶變體基因的大腸桿菌接種到5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過夜；
取上述過夜培養(yǎng)物接種到IOOml新鮮的含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6 0. 8時，加入終濃度0. 5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，繼續(xù)誘導(dǎo)8小時后結(jié)束誘導(dǎo)；
將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)液于轉(zhuǎn)速為5000rpm離心IOmin,棄去上清,菌體用無菌生理鹽水洗滌2遍，在冰浴條件下超聲破胞，破胞條件為功率300瓦，3s工作，6s間歇，90個循環(huán)；超聲破胞后的破胞液在轉(zhuǎn)速為15000rpm，溫度為4°C下離心30min，上清即為粗酶液。
粗酶液用金屬螯合親和層析(IMAC)純化，其中金屬螯合介質(zhì)為Ni-NTA介質(zhì)，透過的純酶在去除咪唑之后，可以進(jìn)行比活力測定及酶學(xué)參數(shù)的測定。
十一、六位點突變酶催化吲哚生成靛藍(lán)比活力及酶學(xué)參數(shù)的測定
按照上述方法進(jìn)行測試，結(jié)果如下
細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)變體酶對靛藍(lán)的比 活力為46. 7 u mol/(nmol .min)，而父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶對靛藍(lán)的比活力為2. 8 ii mol/(nmol min),比活力提高116. 7倍。
細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)變體酶的轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)為 74. 341^11'是父本(28. ISmirT1)的 2. 6 倍，細(xì)胞色素 P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶(4. (MmirT1)的18. 4倍；本發(fā)明變體酶的催化效率(KMt/KM)為25. 11 mT1 ^irT1,是父本(16. 37mM_1 .mirT1)的 I. 5 倍，是細(xì)胞色素 P450 BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶(I. 93mM—1 min—1)的 13. 0 倍。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.—種編碼權(quán)利要求
I所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的基因，其特征在于，堿基序列如SEQID NO. 2所示。
4.ー種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的表達(dá)盒。
5.ー種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的重組載體。
6.如權(quán)利要求
5所述的重組載體，其特征在于，原始載體為pET-28a、、pET-29、pET_30、pET-34 或pRSET。
7.ー種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的轉(zhuǎn)化子?！?br>8.如權(quán)利要求
7所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)BL21、大腸桿菌(E. coli)BLR、大腸桿菌(E. coli)Origami、大腸桿菌(E. coli)NovaBlue或大腸桿菌(E. coli)Rosetta。
9.如權(quán)利要求
I所述的細(xì)胞色素P450BM-3變體酶在催化吲哚生成靛藍(lán)中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶及其編碼基因和用途，該變體酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，它在細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶的基礎(chǔ)上增加了三個突變位點，即第168位的天冬氨酸(GAT)突變?yōu)榱涟彼?CTT)，第435位的谷氨酸(GAA)突變?yōu)樘K氨酸(ACG)，第445位的纈氨酸(GTG)突變?yōu)楸彼?GCG)。與父本酶和原始酶相比，本發(fā)明變體酶具有與底物更高的親和力，催化吲哚生成靛藍(lán)的效率更高。
文檔編號C12N15/63GKCN102747053SQ201210257003
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月24日
發(fā)明者張澎湃, 梅樂和, 胡升, 胡桂香, 金志華, 雷引林 申請人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan