專利名稱:細(xì)胞色素p450bm-3(v445a)變體酶及其編碼基因和用途的制作方法
細(xì)胞色素P450 BM-3 (V445A)變體酶及其編碼基因和用途技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種變體酶，尤其涉及一種細(xì)胞色素P450BM-3 (V445A)變體酶及其編碼基因和用途。
背景技術(shù)：
[0002]靛藍(lán)是一種具有悠久歷史的天然染料，無論是古埃及木乃伊穿著的一些服裝，還是我國馬王堆漢墓出土的藍(lán)色麻織物，它們的顏色都來自靛藍(lán)。靛藍(lán)之所以得到人們長期、 廣泛的青睞，最關(guān)鍵的一點(diǎn)在于它具有其他染料無法比擬的染著牢固度和耐光堅(jiān)牢度，因此，靛藍(lán)也被稱為“染料之王”。[0003]在遠(yuǎn)古時(shí)代，靛藍(lán)主要從含有靛藍(lán)的植物(如菘藍(lán)、寥藍(lán)、木藍(lán)等)中獲得。到了 19世紀(jì)中葉，由于天然靛藍(lán)的生產(chǎn)無法滿足紡織工業(yè)迅猛發(fā)展的需求，人們開始嘗試采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)。1897年，德國巴斯夫生產(chǎn)的合成靛藍(lán)問世，并以生產(chǎn)簡便、原料充足、純度高、易貯運(yùn)、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，得以迅速普及，最終使得應(yīng)用了幾千年歷史的植物靛藍(lán)黯然失色，最終于20世紀(jì)60年代退出了歷史舞臺。20世紀(jì)80年代后，隨著社會文明程度的提高和環(huán)保意識的增強(qiáng)，天然靛藍(lán)重新獲得了人們的關(guān)注和重視。[0004]采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)時(shí)，需要使用對呼吸道、中樞神經(jīng)及肝臟均有毒害、可導(dǎo)致人體中毒的苯胺和鄰苯二甲酸酐。這不僅影響了所合成的靛藍(lán)的安全性，而且也對環(huán)境具有污染。由于而今不可能再大量種植與糧食作物爭地的產(chǎn)靛藍(lán)植物，人們把生產(chǎn)天然靛藍(lán)的希望寄托于靛藍(lán)的生物制備技術(shù)，試圖通過那些能催化吲哚轉(zhuǎn)化為靛藍(lán)的生物催化劑實(shí)現(xiàn)靛藍(lán)的綠色制備。利用生物催化劑進(jìn)行靛藍(lán)的生物制備具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)條件溫和、 能耗低、產(chǎn)生的有害廢物少、產(chǎn)品安全等優(yōu)點(diǎn)，對保護(hù)環(huán)境、維持生態(tài)平衡等具有明顯優(yōu)勢， 所以，生物法生產(chǎn)靛藍(lán)取代靛藍(lán)的化學(xué)合成得到了很多研究者的認(rèn)同和重視。[0005]目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列能催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的生物催化劑，其中最受關(guān)注的是一種細(xì)胞色素P450 BM-3酶。在P450酶系中，細(xì)胞色素P450 BM-3酶是從巨大芽孢桿菌 (B.megaterium)中發(fā)現(xiàn)的具有中長鏈脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和分子氧的存在條件下，可以迅速催化鏈長為C12 C18的飽和脂肪酸末位羥基化，將單個(gè)氧插入到不活潑的碳?xì)滏I中。[0006]2000年，德國斯圖加特大學(xué)技術(shù)生化研究所R.D.Schmi d領(lǐng)導(dǎo)的科研小組， 通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得了具有三個(gè)突變位點(diǎn)、能夠催化吲哚生成靛藍(lán)的細(xì)胞色素 P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶，這使細(xì)胞色素P450BM-3酶第一次獲得了催化靛藍(lán)產(chǎn)生的能力(Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into an indoIe-hydroxylating catalyst，，Chemistry-A European Journal,Li Q S,Schwaneberg U，F(xiàn)ischer P，Schmid R D.2000,6:1531 1536)。但是，該突變酶催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的活力還較低，因此有必要通過進(jìn)一步的蛋白質(zhì)改造，提高細(xì)胞色素P450BM-3酶對吲哚的親和力和催化活力，提高靛藍(lán)生物制備的效率。[0007]公開號分別為“CN 1900285A”、“CN 1900286A”、“CN 1900287A”的中國專利公開了三種細(xì)胞色素P450BM-3酶的變體基因，該三種變體基因分別將第168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榻M氨酸的密碼子、將168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榱涟彼岬拿艽a子、將435位谷氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子，該三種變體基因編碼的細(xì)胞色素P450BM-3酶與底物親和能力較低。
發(fā)明內(nèi)容
[0008]本發(fā)明提供了一種細(xì)胞色素P450BM_3(V445A)變體酶，解決了傳統(tǒng)變體酶與底物親和力較小，熱穩(wěn)定性差，催化吲哚生成靛藍(lán)的效率較低的問題。[0009]一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，命名為細(xì)胞色素 P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/V445A)變體酶，簡稱為細(xì)胞色素 P450 BM-3 (V445A)變體酶。[0010]本發(fā)明通過定點(diǎn)突變，在細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基礎(chǔ)上引入了一個(gè)突變位點(diǎn)，即445位點(diǎn)由纈氨酸(V)突變?yōu)楸彼?A)。該突變位置序號為蛋白不包括起始密碼子編碼氨基酸的順序號。[0011]本發(fā)明還提供了一種編碼所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的基因，其堿基序列可以如SEQ ID N0.2所示。[0012]該基因在通過如下方法獲得:[0013]首先，本發(fā)明根據(jù)細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基因血紅素域的基因序列設(shè)計(jì)飽和定點(diǎn)突變引物，以質(zhì)粒pET28a+P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，再用Dpn I消化模板質(zhì)粒。細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q) 變體酶及其編碼基因已在中國專利00810918.4中公開。[0014]將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)BL21中，篩選獲得突變體，抽取質(zhì)粒，經(jīng)測序可知，其中一個(gè)突變體基因編碼第445位氨基酸的堿基序列由“GTG”突變“GCG”。[0015]本發(fā)明又提供了包含所述基因的表達(dá)盒、重組載體以及轉(zhuǎn)化子。[0016]所述重組載體的原始載體為pET28a(+)、pET-29、pET-30、pET-34 或 pRSET ；[0017]所述轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞大為腸桿菌(E.coli)BL21、大腸桿菌(E.coli)BLR、大腸桿菌(E.coli)Origam1、大腸桿菌(E.coli)NovaBlue、大腸桿菌(E.coli)Rosetta。[0018]本發(fā)明提供了所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶在催化吲哚轉(zhuǎn)化生成靛藍(lán)中的應(yīng)用。[0019]本發(fā)明所獲得的變體酶的酶學(xué)參數(shù)較父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q) 變體酶有顯著改善，轉(zhuǎn)化數(shù)(Keat)相對父本提高了 7.0倍，Km值由父本的2.09mM降低至 0.47mM，導(dǎo)致催化效率(KMt/KM)提高了 31.0倍，說明該本發(fā)明變體酶對底物吲哚具有更高的 催化活力。
具體實(shí)施方式
[0020]一、質(zhì)粒 pET_28a (+) -P45OBM-3 (F87V/A74G/L188Q)[0021 ] 本發(fā)明所使用的質(zhì)粒pET-28a (+) -P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)由德國斯圖加特大學(xué)R.D.Schmid教授惠贈，它是將細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶基因插入原始載體pET-28a (+)的啟動子下游制得，其中突變基因的序列和重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)已記載在中國專利 00810943.5、中國專利 200610052588.0 和文獻(xiàn)(“Directed Evolution of the Fatty-Acid HydroxylaseP450 BM-3 into an Indole-Hydroxylating Catalyst.Chemistry-A European Journal.2000,6 (9): 1531-1536”)中。重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法可以參考現(xiàn)有的一般質(zhì)粒構(gòu)建方法。利用該質(zhì)粒的目的是為了得到細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/ A74G/L188Q)變體酶基因，對載體無特異性要求。[0022]二、飽和突變PCR引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得[0023]根據(jù)細(xì)胞色素P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基因血紅素域部分的堿基序列，設(shè)計(jì)在第445位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變的簡并引物:[0024]上游引物:5’ -GGCTTTNNNGTAAAAGCAAAATCG-3 ’，[0025]下游引物:5’ -TTTTACNNNAAAGCCTTCAGGTTT-3 ’。[0026]PCR反應(yīng)體系為50 μ 1:[0027]即向250 μ I的eppendorf管中加入IOOpmol的dNTPs,各15pmol的上游引物和下游引物，大約2ng的模板質(zhì)粒pET28a+P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)，2.5U高保真pfu聚合酶，終濃度7mM的MgCl2溶液，Pfu緩沖液5 μ I，最后用無菌蒸餾水加至總體積50 μ I。[0028]PCR 程序?yàn)?[0029]95°C預(yù)變性2min后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，即在95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延長 5min，共循環(huán)20次，然后72°C延伸5min，得到定點(diǎn)飽和突變PCR產(chǎn)物。[0030]三、突變文庫的構(gòu)建[0031]將上述獲得的定點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物，經(jīng)過DpnI消化模板基因，獲得突變基因文庫；將所獲突變基因文庫轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)BL21化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有50ng/ml 卡那霉素的LB瓊脂平板上，37°C過夜培養(yǎng)得到相應(yīng)的突變體庫。[0032]四、突變體文庫的篩選及質(zhì)粒測序[0033]從平板上挑取單菌落，用牙簽接菌于每孔裝有Iml LB液體培養(yǎng)基(含有50ng/ml 卡那霉素)的96微孔板中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過夜；[0034]取50 μ I上述過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到一塊新的每孔裝有Iml LB液體培養(yǎng)基(含有 50ng/ml卡那霉素)的96微孔板中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)至0D_ = 0.6 0.8左右，加入終濃度0.5mM的IPTG誘導(dǎo)，于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下誘導(dǎo)12小時(shí)；[0035]加入終濃度0.5mM的吲哚，于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下反應(yīng)10小時(shí)后， 于轉(zhuǎn)速為IOOOOrpm條件下離心I分鐘以收集菌體，用二甲基亞砜萃取菌體上的色素，在分光光度計(jì)上測定波長為670nm處的光吸收值，即靛藍(lán)的光吸收情況，挑選吸收值大于父本的菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。[0036]結(jié)果從待測基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變基因，堿基序列如SEQ ID N0.2所示，該基因編碼第445位氨基酸殘基的密碼子由編碼纈氨酸(GTT)突變?yōu)榫幋a丙氨酸(GCG)，因此該基因編碼的細(xì)胞P450BM-3酶為四位點(diǎn)突變酶:細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/V445A) 變體酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0037]五、細(xì)胞色素P 450BM-3突變酶的分離純化[0038]將攜帶有上述細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/V445A)變體酶基因的大腸桿菌(E.coli)BL21接種到5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過夜；[0039]取上述過夜培養(yǎng)物接種到IOOml新鮮的含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 接種量為2%，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltlS 0.6 0.8時(shí)，加入終濃度0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，繼續(xù)誘導(dǎo)8小時(shí)后結(jié)束誘導(dǎo)；[0040]將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)液于轉(zhuǎn)速為5000rpm離心IOmin,棄去上清,菌體用無菌生理鹽水洗滌2遍，在冰浴條件下超聲破胞，破胞條件為:功率300瓦，3s工作，6s間歇，90個(gè)循環(huán)； 超聲破胞后的破胞液在轉(zhuǎn)速為15000rpm，溫度為4°C下離心30min，上清即為粗酶液。[0041]粗酶液用金屬螯合親和層析(IMAC)純化，其中金屬螯合介質(zhì)為N1-NTA介質(zhì)，透過的純酶在去除咪唑之后，可以進(jìn)行比活力測定及酶學(xué)參數(shù)的測定。[0042]父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶的制備方法同上，區(qū)別在于采用攜帶質(zhì)粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的大腸桿菌(E.coli)BL21 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。[0043]六、催化吲哚生成靛藍(lán)比活力及酶學(xué)參數(shù)的測定[0044]比活力定義為每分鐘每納摩蛋白催化底物吲哚所得到靛藍(lán)的量，單位為ymol靛藍(lán) / (nmol 蛋白.min)。[0045]測定方法:于Iml的IOOmM pH8.2的Tris-Cl反應(yīng)體系中加入Inmol的純酶、終濃度5mM的吲哚，置于37°C保溫IOmin后，加入0.4mg NADPH啟動反應(yīng)，反應(yīng)于溫度為37°C水浴，轉(zhuǎn)速為150rpm避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)IOmin后立即取出，迅速加入6M KOH終止反應(yīng)，于分光光度計(jì)上測定波長為670nm下的光吸收值即為靛藍(lán)的光吸收情況，并根據(jù)靛藍(lán)摩爾消光系數(shù)ε = 3900Μ^.cnT1計(jì)算出靛藍(lán)的濃度。[0046]由此計(jì)算出的細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/V445A)變體酶對靛藍(lán)的比活力為24.5 μ mol/(nmol.π η)，而細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶對靛藍(lán)的比活力為2.8 μ mol/(nmol.min),可見本發(fā)明變體酶的比活力提高了約8.8倍。[0047]其他酶學(xué)參數(shù)通過對酶動力學(xué)曲線的測定獲得，反應(yīng)條件為:于Iml的IOOmM pH8.2的Tris-Cl反應(yīng)體系中加入Inmol的純酶、終濃度I 8mM的吲哚，置于37°C保溫 lOmin，加入0.4mg NADPH啟動反應(yīng)，反應(yīng)在溫度為37°C水浴，轉(zhuǎn)速為150rpm避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)IOmin后立即取出，迅速加入6M KOH終止反應(yīng)，于分光光度計(jì)上測定波長為670nm 處的光吸收值即為靛藍(lán)的光吸收情況，根據(jù)靛藍(lán)摩爾消光系數(shù)ε = 3900Μ—1 ^nT1計(jì)算出靛藍(lán)的濃度。[0048]結(jié)果發(fā)現(xiàn):細(xì)胞色素Ρ450ΒΜ-3 (F87V/A74G/L188Q/V445A)變體酶對靛藍(lán)的Km值為0.47mM，顯著低于父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶的2.09mM，表明本發(fā)明變體酶對底物具有更高的親和力；細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/V445A)變體酶的轉(zhuǎn)化數(shù)(Keat)為28.0SmirT1，是父本變體酶(4.(MmirT1)的7.0倍；本發(fā) 明變體酶的催化效率(Kcat/KM)為 59.75mM_1.mirT1，是父本變體酶(1.93mM_1.mirT1)的 31.0 倍。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—種編碼權(quán)利要求
1所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.一種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的表達(dá)盒。
5.一種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的重組載體。
6.如權(quán)利要求
5所述的重組載體，其特征在于，原始載體為pET28a(+)、pET-29、 pET-30、pET-34 或pRSET。
7.一種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的轉(zhuǎn)化子。
8.如權(quán)利要求
7所 述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)BL21、大腸桿菌(E.coli)BLR、大腸桿菌(E.coli)Origam1、大腸桿菌(E.coli)NovaBlue、大腸桿菌 (E.coli)Rosetta。
9.如權(quán)利要求
1所述的細(xì)胞色素P450BM-3變體酶在催化吲哚生成靛藍(lán)中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞色素P450BM-3(V445A)變體酶及其編碼基因和用途，該變體酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，它在細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)突變位點(diǎn)，即445位的纈氨酸(GTG)突變?yōu)楸彼?GCG)。與父本酶和原始酶相比，本發(fā)明變體酶具有與底物更高的親和力和催化活力，催化吲哚生成靛藍(lán)的效率更高。
文檔編號C12N9/02GKCN102757943 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201210256836
公開日2013年6月5日 申請日期2012年7月24日
發(fā)明者梅樂和, 張澎湃, 胡升, 雷引林, 金志華, 胡桂香 申請人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),