專利名稱:具有增強(qiáng)的3’-錯(cuò)配辨別力的dna聚合酶的制作方法
具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力的DNA聚合酶發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明提供了具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力的DNA聚合酶及它們?cè)诟鞣N應(yīng)用，包括核酸多核苷酸延伸和擴(kuò)增中的用途。[0002]發(fā)明背景DNA聚合酶負(fù)責(zé)基因組的復(fù)制和維護(hù)，這是在世代間(from generation to generation)精確傳遞遺傳信息的中心職責(zé)。DNA聚合酶在細(xì)胞中的功能是作為負(fù)責(zé)DNA 合成的酶。它們?cè)谟薪饘倩罨瘎┤鏜g2+存在的情況下，以被復(fù)制的DNA模板或多核苷酸模板支配的順序聚合脫氧核糖核苷三磷酸。在體內(nèi)，DNA聚合酶參與一系列DNA合成過程，包括DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、重組和基因擴(kuò)增。在每一 DNA合成過程期間，復(fù)制DNA模板一次或最多幾次以產(chǎn)生相同的復(fù)制品。與此相反，在體外，DNA復(fù)制可以重復(fù)多次，例如在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間(參見例如美國專利號(hào)4，683，202)。[0003]在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一輪DNA復(fù)制的開始時(shí)添加的(參見上述美國專利號(hào)4，683，202)。后來，確認(rèn)了從在高溫下生長的細(xì)菌中可獲得熱穩(wěn)定DNA聚合酶，這些酶只需要添加一次(參見美國專利號(hào)4，889，818和美國專利號(hào) 4，965，188)。在PCR期間使用的高溫下，這些酶沒有不可逆地失活。因此，可以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的重復(fù)循環(huán)而不需要在每一合成加成過程開始時(shí)添加新鮮的酶。DNA聚合酶特別是熱穩(wěn)定聚合酶，是重組DNA研究和疾病的醫(yī)療診斷中大量技術(shù)的關(guān)鍵。特別是對(duì)于診斷應(yīng)用，目標(biāo)核酸序列可能僅僅是所考察(in question)DNA或RNA的一小部分，因此在不擴(kuò)增的情況下可能難以檢測(cè)到目標(biāo)核酸序列的存在。[0004]DNA聚合酶的總體折疊模式類似人的右手，包含手掌、手指和拇指三個(gè)獨(dú)特的亞結(jié)構(gòu)域。(參見 beese 等，Science 260:352-355, 1993) ;Patel 等，Biochemistry 34:5351-5363, 1995)。盡管在大小和細(xì)胞功能不同的聚合酶之間手指和拇指亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變化很大，但是催化性的手掌亞結(jié)構(gòu)域全部都是重疊的(superimposable)。例如，在化學(xué)催化作用期間與引入的dNTP相互作用并穩(wěn)定過渡態(tài)的基序A在哺乳動(dòng)物ρο α和原核生物的Pol I家族DNA聚合酶之間是重疊的，平均偏差約為IA (Wang等，Cell 89:1087 -1099，1997)。在結(jié)構(gòu)上基序A以主要包含疏水性殘基的反向平行β-折疊鏈起始，延續(xù)·到α-螺旋。DNA聚合酶活性位點(diǎn)的主要氨基酸序列是特別保守的。在基序A的情況下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:28)保留在從數(shù)百萬年進(jìn)化分離的生物體包括例如水生棲熱菌 iThormus aquaticus)、沙眼衣原體{Chlamydia trachomatis)和大腸桿菌 ipscherichia coli)的聚合酶中。[0005]除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位點(diǎn)也被證明是相對(duì)易變的，能夠容納某些的氨基酸取代而不顯著降低DNA聚合酶活性。(參見例如美國專利號(hào)6，602，695)。這種突變型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反應(yīng)的診斷和研究應(yīng)用中提供各種選擇優(yōu)勢(shì)。因此，本領(lǐng)域需要鑒別適于突變的氨基酸位置以產(chǎn)生改進(jìn)的聚合酶活性。本發(fā)明，如同本文中所述，滿足這些及其它需要。[0006]發(fā)明概述本文提供了相對(duì)于對(duì)應(yīng)的未修飾的對(duì)照聚合酶具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力的DNA聚合酶以及制備和使用這種DNA聚合酶的方法。在一些實(shí)施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是熱活性的DNA聚合酶。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶源自棲熱菌種species)。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶源自棲熱袍菌種 {Thermotoga species)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸，除了對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的對(duì)照DNA聚合酶的氨基酸是S，對(duì)照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的位置處的氨基酸選自G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R或H。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的488位的位置處的氨基酸選自G，A, D, F，K, C，T,或Y。[0007]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶源自棲熱菌種，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的 488位的氨基酸是在中性pH時(shí)，具有極性、不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸(除了 S，例如，N，Q, H, T或Y)，具有非極性、不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸(例如，G，A, L, M, W, P, F，C，V或 I)，具有極性、帶負(fù)電荷的側(cè)鏈的氨基酸(例如，D或E)，或具有極性、帶正電荷的側(cè)鏈的氨基酸(例如，R或K)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的具有極性的、不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸是T或Y ;對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的具有非極性的、不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸是A，F(xiàn)，G，或C ;對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的具有極性的、帶負(fù)電荷的側(cè)鏈的氨基酸是D ;以及對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的具有極性的、帶正電荷的側(cè)鏈的氨基酸是K。[0008]而且，根據(jù)本發(fā)明，位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的氨基酸附近的其它氨基酸也可以被突變，以產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)應(yīng)的未修飾的對(duì)照聚合酶具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力的酶。例如，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493和/或497位的氨基酸的突變也產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)應(yīng)的未修飾的對(duì)照聚合酶具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力的酶。[0009]在一些實(shí)施方案中，具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結(jié)構(gòu)域中包含基序，所述基序 包含A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,其中XI是 H，E 或 Q;X2 是 P，T 或 E;X3是N或H ;X4是L或I ;X5是N或R ;X6是除S以外的任何氨基酸；X7 是 R，P，或 S ;X8 是〕，K 或 T;X9是L或V ;X10 ^ E, S，A 或 G;XII是 R，N, Y, T 或V;X12是V或I ;X13是F或Y ;X14是0或E ;和X15是￡ 或K (SEQ ID NO:8)。[0010]在一些實(shí)施方案中，X6選自 G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R 或 H (SEQ ID NO:49)。[0011]在一些實(shí)施方案中，具有增強(qiáng)的3’-錯(cuò)配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結(jié)構(gòu)域中包含基序，所述基序包含A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X1J-X12-L-F-X14-X1S-L,其中X1是H或EjPX4是L或I ;X6是除S以外的任何氨基酸X7是R或PX8是D或KX9是L或VXltl是E或SX1A R 或NX12是V或IX14是D或E和X15是E或K(SEQ ID NO:9)ο[0012]在一些實(shí)施方案中，具有增強(qiáng)的3’-錯(cuò)配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結(jié)構(gòu)域中包含基序，所述基序包含A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-E-R-V-L-F-D-E-L,其中X6是除S以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 10)。[0013]在一些實(shí)施方案中，X6是 G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R或H (SEQ ID N0:49)。在一些實(shí)施方案中，Xes具有非極性、不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸 (例如，G，A, L, M, W, P, F，C，V,或I)。在一些實(shí)施方案中，X6是具有極性、不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸(除了 S，例如，N，Q, H, T,或Y)。在一些實(shí)施方案中，X6是具有極性、 帶負(fù)電荷的側(cè)鏈的氨基酸(例如，D或E)。在一些實(shí)施方案中，X6是具有極性、帶正電荷的側(cè)鏈的氨基酸(例如，R或K)。在一些實(shí)施方案中，X6是6，A, D, F，K, C，T，或Y (SEQ ID NO:11)。[0014]在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D 或E以外的任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的580位的 DNA聚合酶的氨基酸選自L，G, T, Q, A, S，N, R和K。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是G。[0015]在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶進(jìn)一步包含在對(duì)應(yīng)于選自SEQ ID NO:1的493和/ 或497的位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處的突變。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的 493位的DNA聚合酶的氨基酸是除E，S，A，或G以外的任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中， 對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的氨基酸選自Q，R, V, L, I, M, F，W, P, T, C，N, D, Y, K,或H。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的氨基酸選自K或R。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶源自棲熱菌種，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493位的DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸。例如，當(dāng)DNA聚合酶源自棲熱菌種時(shí)，DNA聚合酶進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493位的位置處的選自S， A, G, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, K, R 或 H 的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493位的位置處的氨基酸選自S，A, Q, G, K,或R。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493位的位置處的氨基酸選自A，G, K,或R。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的493位的位置處的氨基酸是K。[0016]在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶的氨基酸在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的497位的位置處可以進(jìn)一步包含除F或Y以外的任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的 497 位的 DNA 聚合酶的氨基酸選自 R，V, L, I, M, W, P, T, C，N, D, E, S，A, G, K, E或H。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸選自A， G, S，T, D或K。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶源自棲熱菌種，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸是除F以外的任何氨基酸。因此，在一些實(shí)施方案中， 當(dāng)DNA聚合酶源自棲熱菌種時(shí)，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸選自 R, V, L, I, M, W, P, T, C，N, D, E, S，A, G, K, E, H 或 Y。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸是A, G, S，T, Y, D,或K。[0017]各種DNA聚合酶適于本發(fā)明的突變。尤其適合的是熱穩(wěn)定聚合酶，包括來自各 種嗜熱菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的熱穩(wěn)定聚合酶，以及通過氨基酸取代、插入或缺失或其它修飾而源自這種野生型或天然存在的酶的合成的熱穩(wěn)定聚合酶。示例性的聚合酶的未修飾形式包括例如CS5 (SEQ ID N0:29)或CS6(SEQ ID NO: 30) 或Z05 DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)，或與其具有至少80%、優(yōu)選至少90%或更優(yōu)選至少95% 的序列同一性的功能性DNA聚合酶。其它未修飾的聚合酶包括例如來自于下列嗜熱菌中任一種的DNA聚合酶(或與這種聚合酶具有至少80%、優(yōu)選至少90%或更優(yōu)選至少95%的序列同一性的功能性DNA聚合酶)海棲熱袍菌{Thermotoga maritima) (SEQ ID NO: 38)； 水生棲熱菌 kThermus aquaticus) (SEQ ID NO:2);嗜熱棲熱菌(Jhermus thermophilus) (SEQ ID NO:6);黃棲熱菌(Jlwrmus flavus) (SEQ ID NO:4);絲狀棲熱菌 iThormus filiformis) (SEQ ID NO: 3);棲熱菌種 Spsl7sp. spsl7) (SEQ ID NO: 5);棲熱菌種 Z05 sp. Z05) (SEQ ID NO:1);那不勒斯棲熱袍菌(Jhermotoga neopolitana) (SEQ ID NO:39);非洲棲熱腔菌{Thermosipho africanus) (SEQ ID NO:37) ；Thermus caldophilus (SEQ ID NO:7),耐放射異常球菌{Deinococcus radiodurans) (SEQ ID NO: 36)，嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus s tearo thermophi I us) (SEQ ID NO: 40)或熱堅(jiān)芽孢桿菌{Bacillus caldotenax) (SEQ ID NO:41)。合適的聚合酶還包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT) 活性和/或能夠摻入非常規(guī)核苷酸如核糖核苷酸或其它2’ -修飾的核苷酸的那些。[0018]盡管具有有效的3’ -錯(cuò)配辨別力活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶尤其適合用于進(jìn)行 PCR,具有有效的3’ -錯(cuò)配辨別力活性的熱活性的、但不是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶也適于本發(fā)明的突變。[0019]在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是棲熱菌屬DNA聚合酶。例如，在一些實(shí)施方案中， DNA聚合酶與選自下列的聚合酶具有至少80%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%的序列同一性(a)棲熱菌種ZOOTNA 聚合酶(ZO5) (SEQ ID NO:1);(b)水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq)(SEQ ID NO: 2);(c)絲狀棲熱菌DNA聚合酶(Tfi)(SEQ ID NO: 3);(d)黃棲熱菌DNA 聚合酶(Tfl) (SEQ ID NO:4);(e)棲熱菌種Spsl7DNA 聚合酶(Spsl7) (SEQ ID NO: 5);(f)嗜熱棲熱菌DNA聚合酶(Tth)(SEQ ID NO:6);和(g)Thermus caldophilus DN A 聚合酶(Tea) (SEQ ID NO: 7)。[0020]在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是棲熱袍菌DNA聚合酶。例如，在一些實(shí)施方案中， DNA聚合酶與選自下列的聚合酶具有至少80%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%的序列同一性(a)海棲熱袍菌DNA聚合酶(Tma)(SEQ ID NO: 38);(b)那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶(Tne)(SEQ ID NO: 39);在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶與SEQ ID NO:1具有至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是棲熱菌種Z05 DNA聚合酶(Z05) DNA聚合酶(即SEQ ID NO:1)，除了 488位的氨基酸是除S以外的任何氨基酸。例如，在一些實(shí)施方案中，488位的氨基酸選自G，A, V, L, I, M, F，W, P, T, C，Y, N, Q, D, E, K, R或H。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，488位的氨基酸是除S以外的任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，488位的氨基酸是A，D,F，G, K, C，T或Y。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是進(jìn)一步包含580位的取代的Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，DNA 聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸選自L，G, T, Q, A, S，N, R和K。在一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是G。[0021]突變的或改進(jìn)的聚合酶可以包括其它非取代的修飾。一種這種修飾是熱可逆的共價(jià)修飾，其使酶失活，但是在高溫，如通常用于多核苷酸延伸的溫度下孵育后其被逆轉(zhuǎn)而激活酶。美國專利號(hào)5，773，258和5，677，152中描述了這種熱可逆的修飾的示例性試劑。[0022]在一些實(shí)施方案中，通過在具有預(yù)定拷貝數(shù)的野生型BRAF V600R目標(biāo)多核苷酸和預(yù)定拷貝數(shù)的突變型BRAF V600目標(biāo)多核苷酸(數(shù)量上等于或少于野生型目標(biāo)的拷貝數(shù)(例如，10，000或更少拷貝))的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)混合物中在正向引物(與突變型序列完美匹配并且與野生型序列具有一個(gè)單一的3’A:C錯(cuò)配)存在的情況下使用具有SEQ ID N0:35(野生型BRAF = SEQ ID NO:34)的核酸序列的突變型BRAF V600R目標(biāo)多核苷酸而測(cè)定3’-錯(cuò)配活性。兩個(gè)或更多的反應(yīng)混合物可以具有滴定的拷貝數(shù)的突變型BRAF V600R 目標(biāo)多核苷酸(例如，在數(shù)個(gè)反應(yīng)混合物中，1:5滴定，1:10滴定，例如，10，000拷貝，1000 拷貝，100拷貝，10拷貝，I拷貝，O拷貝)。如本文中所述，可以在預(yù)先選擇的單位時(shí)間，將本發(fā)明的聚合酶的3’ -錯(cuò)配辨別力與參照聚合酶(例如，天然存在的或未修飾的聚合酶)的3’-錯(cuò)配辨別力相比較。當(dāng)與突變型等位基因完美匹配的引物接觸時(shí)，具有增強(qiáng)的 3’ -錯(cuò)配辨別力的聚合酶將不能擴(kuò)增野生型序列，或者，與天然存在的或未修飾的聚合酶相比，使用突變型等位基因特異性引物擴(kuò)增野生型序列將需要更大的PCR循環(huán)數(shù)(即，表現(xiàn)出更高的Cp值)。[0023]在各種其它方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述的突變的或改進(jìn)的DNA聚合酶的重組核酸，包含該重組核酸的載體，和/或用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中， 所述載體是表達(dá)載體。包含這種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可用于本發(fā)明的生產(chǎn)突變的或改進(jìn)的聚合酶的方法，所述方法通過在適于表達(dá)重組核酸的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。反應(yīng)混合物和 /或試劑盒中可以包含本發(fā)明的聚合酶。重組核酸，宿主細(xì)胞，載體，表達(dá)載體，反應(yīng)混合物和試劑盒的實(shí)施方案如上面和本文中所述。[0024]在另一方面，提供了實(shí)施多核苷酸延伸的方法。該方法總體包括在適于引物延伸的條件下將本文所述的具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力的DNA聚合酶與引物、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接觸，從而產(chǎn)生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。三磷酸核苷可以包括非常規(guī)核苷酸如核糖核苷酸和/或標(biāo)記的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一個(gè)或更多個(gè)核苷酸類似物。在一些變型中，多核苷酸延伸方法是用于多核苷酸擴(kuò)增的方法，包括在適于多核苷酸擴(kuò)增的條件下將突變的或改進(jìn)的DNA聚合酶與引物對(duì)、 多核苷酸模板以及三磷酸核苷接觸。多核苷酸延伸反應(yīng)可以是，例如，PCR，等溫延伸，或測(cè)序(例如，454測(cè)序反應(yīng))。[0025]在一些實(shí)施方案中，引物延伸方法是用于實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法。[0026]本發(fā)明還提供了用于這種多核苷酸延伸方法中的試劑盒。通常，試劑盒包括至少一個(gè)提供本文所述的突變的或改進(jìn)的DNA聚合酶的容器。在某些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括提供一種或更多種額外試劑的一個(gè)或更多個(gè)額外的容器。例如，在特定的變型中，一個(gè)或更多個(gè)額外的容器提供三磷酸核苷；適于多核苷酸延伸的緩沖劑；和/或在多核苷酸延伸條件下與預(yù)定的多核苷酸模板雜交的引物。進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的聚合酶的反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一種或多種引物或探針多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，標(biāo)記的核苷酸，非常規(guī)的核苷酸)，緩沖劑，鹽，標(biāo)記(例如，突光團(tuán))。[0028]本文描述了本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案。[0029]定義除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。盡管基本上與本文所述的那些相似的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但是僅僅描述了示例性的方法和材料。對(duì)于本發(fā)明的目的，下列術(shù)語定義如下。[0030]術(shù)語“一(a)，” “一(an)，”和“該(the) ”包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文清楚地指出別的含義。[0031 ] “氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何單體單位。如本文所用，術(shù)語“氨基酸”包括下列20種天然或遺傳編碼的α-氨基酸丙氨酸(Ala或Α)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸 (Glu或Ε)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或 S)、蘇氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。在其中“X” 殘基沒有定義的情況下，這些應(yīng)該定義為“任何氨基酸”。這20種天然氨基酸的結(jié)構(gòu)見例如 Stryer 等，BioChemistry, 5th ed. , Freeman and Company (2002)。額外的氨基酸如硒代半胱氨酸和卩It咯賴氨酸也能夠被遺傳編碼(Stadtman (1996) iiSelenocysteinej ” Annu Rev Biochem. 65:83-100 和 Ibba 等.(2002) “Genetic code:1ntroducing pyrrolysine，，， Curr Biol. 12(13) :R464-R466)。術(shù)語“氨基酸”還包括非天然氨基酸、修飾的氨基酸(例如， 具有修飾的側(cè)鏈和/或骨架)和氨基酸類似物。參見，例如，Zhang等.(2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells, ” Proc. Natl. Acad. Sc1. U.S.A. 101 (24) :8882-8887，Anderson 等.(2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon，，Proc. Natl. Acad. Sc1. U.S.A. 101 (20) : 7566-7571, Ikeda 等· (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo, ” Protein Eng. Des. Sel. 16 (9) :699-706, Chin 等·(2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code，，，Science 301(5635) :964-967, James 等· (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues, ” Protein Eng. Des. Sel. 14(12) :983-991，Kohrer 等.(2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells:A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins, ” Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 98(25):14310-14315, Bacher 等· (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue，” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425， Hamano-Takaku 等· (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, ” J. Biol. Chem. 275 (51) :40324_40328，和Budisa等· (2001) “Proteins with {beta} -(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids, ” Protein Sc1. 10 (7):1281-1292。[0032]為了進(jìn)一步說明，氨基酸典型地為包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一種或多種側(cè)鏈或基團(tuán)，或·這些基團(tuán)的任一種的類似物的有機(jī)酸。示例性的側(cè)鏈包括，例如疏基、砸基、橫酸基、焼基、芳基、酸基、麗基、置氣基、輕基、餅、氰!基、齒素、酸餅、 鏈烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸鹽(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺或這些基團(tuán)的任何組合。其它代表性的氨基酸包括但不限于， 包含光敏交聯(lián)劑的氨基酸、金屬結(jié)合氨基酸、自旋標(biāo)記的氨基酸、發(fā)熒光的氨基酸、包含金屬的氨基酸、含新官能團(tuán)的氨基酸、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸、對(duì)光不穩(wěn) (photocaged)和/或可光異構(gòu)化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修飾的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、 重原子取代的氨基酸、化學(xué)可裂的和/或光可裂的氨基酸、包含碳連接糖的氨基酸、氧化還原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一個(gè)或多個(gè)毒性部分的氨基酸。[0033]術(shù)語“適配子”是指識(shí)別并結(jié)合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的單鏈DNA，如美國專利號(hào)5，693，502中所述。[0034]在本發(fā)明的DNA聚合酶上下文中的術(shù)語“突變體”是指相對(duì)于對(duì)應(yīng)的天然存在的或未修飾的DNA聚合酶包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的多肽，典型為重組的。[0035]在突變型聚合酶上下文中的術(shù)語“未修飾的形式”在本文中是用來定義本發(fā)明的突變型DNA聚合酶的術(shù)語術(shù)語“未修飾的形式”是指具有除指定為表征突變型聚合酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置以外的突變型聚合酶的氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，在(a) 其未修飾的形式和(b) —個(gè)或多個(gè)特定氨基酸取代的方面提到突變型DNA聚合酶是指除特定的氨基酸取代以外，突變型聚合酶在特定的基序中另外具有與未修飾的形式相同的氨基酸序列?！拔葱揎椀木酆厦浮?和因此還有具有增強(qiáng)的3’-錯(cuò)配辨別力的修飾的形式)可以包含額外的突變以提供期望的功能性，例如雙脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸類似物、染料標(biāo)記的核苷酸的改進(jìn)的摻入，調(diào)節(jié)5’ -核酸酶活性，調(diào)節(jié)3’ -核酸酶(或校正) 活性等。因此，在實(shí)施本文所述的本發(fā)明時(shí)，DNA聚合酶的未修飾的形式是預(yù)先確定的。DNA 聚合酶的未修飾的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已經(jīng)有意識(shí)地修飾過的DNA聚合酶。聚合酶的未修飾的形式優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶,如來自各種嗜熱菌的 DNA聚合酶以及與野生型或天然存在的熱穩(wěn)定聚合酶具有基本上序列同一性的其功能性變體。這種變體可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶，如美國專利號(hào)6，228，628和美國申請(qǐng)公開號(hào)2004/0005599中所述的嵌合DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，聚合酶的未修飾的形式具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。[0036]術(shù)語“熱穩(wěn)定聚合酶”是指對(duì) 熱穩(wěn)定的酶，其是耐熱的，當(dāng)經(jīng)受高溫并持續(xù)影響雙鏈核酸變性所必需的時(shí)間時(shí)，其保留足夠的活性以影響隨后的多核苷酸延伸反應(yīng)，并且沒有變得不可逆變性的(失活的)。核酸變性所需的加熱條件是本領(lǐng)域公知的，在例如美國專利號(hào)4，683，202,4, 683，195和4，965，188中舉例說明。如本文所述，熱穩(wěn)定聚合酶適于在溫度循環(huán)變化的反應(yīng)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)中使用。用于本文目的的不可逆變性指酶活性的永久且完全的損失。對(duì)于熱穩(wěn)定聚合酶，酶活性是指以適當(dāng)?shù)姆绞酱呋塑账岬慕M合以形成與模板核酸鏈互補(bǔ)的多核苷酸延伸產(chǎn)物。來自嗜熱菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶包括，例如來自海棲熱袍菌，水生棲熱菌，嗜熱棲熱菌，黃棲熱菌，絲狀棲熱菌，棲熱菌種Spsl7，棲熱菌種Z05, Thermus熱堅(jiān)芽孢桿菌,那不勒斯棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌的DNA 聚合酶。[0037]術(shù)語“熱活性的”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反應(yīng)中逆轉(zhuǎn)錄或退火/延伸步驟的溫度(即，45-80°C )保持催化性能的酶。熱穩(wěn)定酶是當(dāng)經(jīng)受對(duì)于核酸變性所必需的高溫時(shí)不會(huì)被不可逆地失活或變性的那些酶。熱活性的酶可以是或可以不是熱穩(wěn)定的。熱活性的DNA聚合酶可以是DNA或RNA依賴于嗜熱種或依賴于嗜常溫種，包括但不限于，大腸桿菌，莫洛尼小鼠白血病病毒和禽成髓細(xì)胞瘤病毒(Avian myoblastosis virus) 0[0038]如本文使用的，“嵌合”蛋白是指氨基酸序列代表來自至少兩種不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合產(chǎn)物的蛋白。嵌合蛋白典型地不是通過氨基酸序列的直接操作產(chǎn)生， 而是從編碼該嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表達(dá)的。在某些實(shí)施方案中，例如，本發(fā)明的突變型DNA聚合酶的未修飾形式是由來源于棲熱菌種DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)區(qū)域和來源于Tma DNA聚合酶的羧基末端(C-末端)區(qū)域組成的嵌合蛋白。N-末端區(qū)域是指從N-末端(氨基酸位置I)延伸到內(nèi)部氨基酸的區(qū)域。類似地，C-末端區(qū)域是指從內(nèi)部氨基酸延伸到C-末端的區(qū)域。[0039]在DNA聚合酶的上下文中，與另一條序列(例如區(qū)域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“對(duì)應(yīng)”是基于根據(jù)核苷酸或氨基酸位置數(shù)編號(hào)并且然后以最大化序列同一性百分比的方式比對(duì)序列的規(guī)則。因?yàn)椴皇墙o定的“對(duì)應(yīng)區(qū)域”內(nèi)的所有位置都需要是相同的，對(duì)應(yīng)區(qū)域內(nèi)的非匹配位置可以被認(rèn)為是“對(duì)應(yīng)位置”。因此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的 “對(duì)應(yīng)于氨基酸位點(diǎn)[X]的氨基酸位置”是指，基于比對(duì)，在其它DNA聚合酶和結(jié)構(gòu)同源物和家族中的等效位置。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，氨基酸位置的“對(duì)應(yīng)”是根據(jù)包含SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39，40或41的一個(gè)或多個(gè)基序的聚合酶區(qū)域來確定的。當(dāng)聚合酶多肽序列不同于SEQ ID N0S:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39， 40或41 (例如，通過氨基酸的變化或氨基酸的增加或缺失)時(shí)，可能與本文所討論的改進(jìn)的活性相關(guān)的特定突變將不是在與它在SEQ ID N0S:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38， 39，40或41中相同的位置數(shù)。例如，在表I中說明了這一點(diǎn)。[0040]如本文使用的，“重組體”是指已經(jīng)通過重組方法有意識(shí)地修飾過的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的術(shù)語“重組核酸”是指通常通過內(nèi)切核酸酶的核酸操作，最初在體外形成的以自然中通常不存在的形式的核酸。因此，線性形式的分離的突變型DNA聚合酶核酸或通過連接通常不結(jié)合的DNA分子體外形成的表達(dá)載體都被認(rèn)為是用于本發(fā)明的目的的重組體?？梢岳斫獾氖牵坏┲亟M核酸被制備并重新引入宿主細(xì)胞，它將非重組地復(fù)制， 即，使用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制而不是體外操作；然而，這種核酸一旦重組產(chǎn)生，盡管隨后非重組復(fù)制，仍然被認(rèn)為是用于本發(fā)明的目的的重組體?！爸亟M蛋白”是使用重組技術(shù)，即通過上述重組核酸的表達(dá)制備的蛋白。[0041]當(dāng)被置于與另一種核酸序列的功能性關(guān)系時(shí)核酸是“可操作連接的”。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是與編碼序列可操作連接的；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被定位以促進(jìn)翻譯，那么它是與編碼序列可操作連接的。[0042]術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指單細(xì)胞的原核生物和真核生物有機(jī)體(例如細(xì)菌、酵母和放線菌)以及細(xì)胞培養(yǎng)物中生長的來自高等植物或者動(dòng)物的單個(gè)細(xì)胞。[0043]術(shù)語“載體”指一條DNA，典型是雙鏈的，它可以是其中已經(jīng)插入了一條外源DNA 的。載體可以 是例如質(zhì)粒來源的。載體包含在宿主細(xì)胞中促進(jìn)載體的自主復(fù)制的“復(fù)制子” 多核苷酸序列。外源DNA定義為異源的DNA，其是在宿主細(xì)胞中天然不存在的DNA，例如，其復(fù)制載體分子，編碼可選擇或可篩選的標(biāo)記，或者編碼轉(zhuǎn)基因。載體用于轉(zhuǎn)運(yùn)外源的或異源的DNA進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞。一旦在宿主細(xì)胞中，載體可以獨(dú)立于宿主染色體DNA復(fù)制或與宿主染色體DNA同時(shí)復(fù)制，可以產(chǎn)生數(shù)個(gè)拷貝的載體及其插入的DNA。另外，載體還可以包含容許插入的DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA分子或者使插入的DNA復(fù)制為多拷貝的RNA的必要元件。 一些表達(dá)載體還包括插入的DNA附近的序列元件，其增加表達(dá)的mRNA的半衰期，和/或允許所述mRNA翻譯為蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的DNA編碼的mRNA和多肽的許多分子。[0044]術(shù)語“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體以外，本文中還應(yīng)當(dāng)理解為是指其相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體，包括衍生物和類似物，其對(duì)于使用該核苷酸的特定上下文(例如，與互補(bǔ)堿基雜交)在功能上是等效的，除非上下文明確另外指明。[0045]術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物，其可以對(duì)應(yīng)于核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)聚合物或其類似物。這包括核苷酸的聚合物如RNA和DNA，以及其合成形式、修飾(例如化學(xué)或生物化學(xué)修飾的)形式，和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亞單位)。示例性的修飾包括甲基化，用類似物取代一個(gè)或更多個(gè)天然存在的核苷酸，核苷酸間的修飾如不帶電的鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸鹽等)，側(cè)面部分(例如多肽)，嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)，螯合劑，烷化劑，和修飾的鍵(例如α異頭核酸等)。還包括模擬多核苷酸通過氫鍵及其他化學(xué)相互作用與指定序列結(jié)合的能力的合成分子。雖然合成形式的核酸可以包括其它鍵(例如，Nielsen等(Science 254:1497權(quán)利要求
1.DNA聚合酶，與對(duì)照DNA聚合酶相比，所述DNA聚合酶具有增強(qiáng)的3’ -錯(cuò)配辨別力活性，其中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的所述DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸，其中除了對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的488位的所述對(duì)照DNA聚合酶的氨基酸是S，所述對(duì)照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶結(jié)構(gòu)域中包含基序，所述基序包含 A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,其中
或Q; X2是P、T或E; X3是N或H ; X4是L或I ; X5是N或R ; X6是除S以外的任何氨基酸； 父7是1 、？、或3; 父8是0、1(或T ; X9是L或V ; X1。是E、S、A或G ;
X11 是 R、N、Y、T 或 V ; X12是V或I ; X13是F或Y ; 父14是0或E ;以及 父15是￡ 或K (SEQ ID NO:8)。
3.權(quán)利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶結(jié)構(gòu)域中包含基序，所述基序包含 A-G-X1-P-F-N-X4-N-X6-X7-X8-Q-X9-X10-X1J-X12-L-F-X14-X1S-L,其中 X1是H或E ; X4是L或I ; X6是除S以外的任何氨基酸； X7是R或P ; X8是D或K ; X9是L或V ;
Xltl 是 E 或 S ; X11是R或N; X12是V或I ; 父14是0或E ;以及 父15是￡ 或K (SEQ ID NO:9)。
4.權(quán)利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶結(jié)構(gòu)域中包含基序，所述基序包含 A-G-H-P-F-N-L-N-X6-R-D-Q-L-E-R-V-L-F-D-E-L,其中 X6是除S以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 10)。
5.權(quán)利要求
4的0嫩聚合酶，其中乂6是6、八、0、？、1(、(、1'或￥(SEQ ID NO: 11)。
6.權(quán)利要求
1-5中任一項(xiàng)的DNA聚合酶，其中對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1的580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。
7.權(quán)利要求
1-6中任一項(xiàng)的DNA聚合酶，其中對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1的580位的氨基酸選自 L、G、T、Q、A、S、N、R 和 K。
8.權(quán)利要求
1-7中任一項(xiàng)的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含與SEQID N0:l、2、3、4、5、6、7、36、37、38、39、40或41至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%序列相同的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求
6或7中任一項(xiàng)的DNA聚合酶，其中所述聚合酶與SEQID NO:1具有至少 80%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%的序列同一'丨生。
10.權(quán)利要求
9的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是Z05DNA聚合酶，所述580位的氨基酸選自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。
11.重組核酸,其編碼權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的DNA聚合酶。
12.進(jìn)行引物延伸的方法，包括在適于引物延伸的條件下將權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的DNA聚合酶與引物、多核苷酸模板和三磷酸核苷接觸，從而產(chǎn)生延伸的引物。
13.產(chǎn)生延伸的引物的試劑盒，包括至少一個(gè)提供權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的DNA聚合酶的容器。
14.權(quán)利要求
13的試劑盒，進(jìn)一步包括一個(gè)或更多個(gè)額外的容器，所述容器選自(a)容器，其提供在引物延伸條件下與預(yù)定的多核苷酸模板可雜交的引物；(b)容器，其提供三磷酸核苷；以及(c)容器，其提供適合用于引物延伸的緩沖劑。
15.反應(yīng)混合物，包含權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的DNA聚合酶，至少一種引物，多核苷酸模板和三磷酸核苷。
專利摘要
公開了相對(duì)于對(duì)應(yīng)的未修飾的聚合酶具有增強(qiáng)的3′-錯(cuò)配辨識(shí)力的突變型DNA聚合酶。突變型聚合酶可用于多種公開的引物延伸方法中。還公開了相關(guān)的組合物，包括可用于，例如，突變型DNA聚合酶生產(chǎn)的重組核酸、載體以及宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N9/12GKCN103003418SQ201180036364
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年6月17日
發(fā)明者F.賴切特, K.鮑爾, T.W.邁爾斯 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan