專利名稱:生產(chǎn)粘康酸和粘康酸鹽的異構(gòu)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及從可再生原料中生物生產(chǎn)粘康酸鹽。本發(fā)明更具體涉及從可再生的生物質(zhì)衍生碳源生產(chǎn)粘康酸鹽異構(gòu)體以及其前體和衍生物。
技術(shù)背景
2012年世界范圍內(nèi)對(duì)苯二甲酸二甲酯(DMT)消耗預(yù)計(jì)平均值為397萬(wàn)公噸。DMT是對(duì)苯二甲酸和甲醇的酯并用于包括聚對(duì)苯二甲酸乙二酯和聚對(duì)苯二甲酸丙二酯在內(nèi)的 聚酯生產(chǎn)。DMT還是用于生產(chǎn)工業(yè)塑料、汽車部件、膜、魚(yú)線和食品包裝材料的主要成分。
通常，DMT生產(chǎn)利用通過(guò)對(duì)二甲苯催化均質(zhì)氧化產(chǎn)生的對(duì)苯二甲酸和甲醇的酯化反應(yīng)。例如，液體對(duì)二甲苯可在鈷鹽催化劑存在時(shí)被空氣氧化，形成含對(duì)甲苯酸和對(duì)苯二甲酸一甲酯的氧化物，并可在甲醇存在時(shí)進(jìn)行酯化反應(yīng)產(chǎn)生DMT。
偏苯三酸(TMA)是另一種市售的重要產(chǎn)物，用作化學(xué)工業(yè)的中間物，包括粉末涂料樹(shù)脂、墨水、導(dǎo)線釉、低揮發(fā)性的高性能增塑劑和用于高溫應(yīng)用的工程改造的聚合物。TMA還可脫水產(chǎn)生偏苯三酸酐，其為另一種市售重要起始材料，用于生產(chǎn)聚合物和化學(xué)中間物。
通常，TMA通過(guò)偏三甲苯(1，2，4-三甲基苯)的氧化生產(chǎn)。對(duì)苯二甲酸和間苯二甲酸可在存在乙酸作為溶劑并存在包括鈷、錳和溴的催化系統(tǒng)時(shí)通過(guò)液相氧化對(duì)二甲苯或間二甲苯而商業(yè)生產(chǎn)。
這些過(guò)程與生產(chǎn)許多其他市售重要化學(xué)前體、中間物和產(chǎn)物的方法一樣不理想，這是由于過(guò)于依賴環(huán)境敏感且不可再生的原料(如石油原料)和其產(chǎn)生不需要副產(chǎn)物(如溫室氣體、重金屬、鹵素、致癌烴)的傾向。因此，需要利用可再生原料生產(chǎn)DMT、TMA以及其他化學(xué)產(chǎn)物的改良方法和系統(tǒng)。
如Frost等的美國(guó)公開(kāi)號(hào)2010/0314243和Frost等的國(guó)際公開(kāi)號(hào)2010/148049所述(二者的公開(kāi)通過(guò)引用全文納入本文)，DMT和TMA可從粘康酸生產(chǎn)。此外，粘康酸鹽也稱為2，4-已二烯二酸，由于其雙鍵和二酸功能性而可進(jìn)行廣泛的反應(yīng)。已知許多粘康酸衍生物，包括內(nèi)酯、砜、聚酰胺、聚脂、硫酯、加成聚物和其他化合物。該化合物具有廣泛的應(yīng)用，包括用作表面活性劑、阻燃劑、UV光穩(wěn)定劑、熱固性塑料、熱塑性塑料和包被。因此，非常需要從可再生原料中生物生產(chǎn)粘康酸或粘康酸鹽的方法以用于生產(chǎn)DMT、TM和其他化學(xué)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的描述使用術(shù)語(yǔ)“粘康酸鹽”和“粘康酸”。術(shù)語(yǔ)“粘康酸”指羧酸官能團(tuán)被質(zhì)子化且分子形式上是無(wú)電荷化學(xué)種(neutral species)的化學(xué)物質(zhì)。粘康酸的化學(xué)式為H00C-CH=CH_CH=CH — COOH。術(shù)語(yǔ)“粘康酸鹽”指對(duì)應(yīng)的去質(zhì)子化化學(xué)種類，其中一種或兩種羧酸官能團(tuán)被去質(zhì)子化，以產(chǎn)生陰離子或雙陰離子形式，其在生理pH值下為主要化學(xué)種類。然而，術(shù)語(yǔ)“粘康酸”和“粘康酸鹽”指同一分子的質(zhì)子化或去質(zhì)子化形式，所述術(shù)語(yǔ)同義使用，其中分子的質(zhì)子化和去質(zhì)子化(如非電離和電離)形式之間的差異并非有效區(qū)分。
本發(fā)明提供用于從生物質(zhì)衍生碳源中生產(chǎn)所述粘康酸鹽三種異構(gòu)體，即順順、順?lè)春头捶串悩?gòu)體以及其前體和衍生物的方法。所述異構(gòu)體通過(guò)環(huán)繞兩個(gè)雙鍵的幾何形狀而在結(jié)構(gòu)上不同。此外，所述異構(gòu)體可具有不同的物理特性(如熔點(diǎn))和化學(xué)反應(yīng)性。所述方法可包括來(lái)自易獲得碳源的微生物生物合成產(chǎn)物，所述碳源能在具有芳族氨基酸生物合成共同途徑的微生物中通過(guò)生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)槌嗵\糖4-磷酸鹽(E4P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。
一種優(yōu)選的碳源是D葡萄糖。能用于本發(fā)明的D葡萄糖和其他碳源優(yōu)選無(wú)毒。此夕卜，該碳源可再生，其衍生自淀粉、纖維素，和玉米、甘蔗、甜菜、木漿和其他生物質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)的糖。適于促進(jìn)本發(fā)明各步驟的宿主微生物有機(jī)體可選自具有芳族氨基酸生物合成共同內(nèi)源途徑的屬。優(yōu)選的宿主生物體包括遺傳工程改造以表達(dá)所選肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)和乙酸I丐不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的內(nèi)源基因的大腸桿菌(Escherichia coli)突變株。用于本發(fā)明的一種優(yōu)選大腸桿菌(E. coli)突變體是大腸桿菌AB2834，這是一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體，其由于編碼莽草酸脫氫酶的aroE基因座中的突變而不能催化芳族氨基酸生物合成共同途徑的中間產(chǎn)物3-脫氫莽草酸(DHS)轉(zhuǎn)變?yōu)槊Р菟帷?br>芳族氨基酸生物合成共同途徑在細(xì)菌和植物中產(chǎn)生芳族氨基酸苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。所述共同途徑以分子分支酸(chorismate)結(jié)束，其后續(xù)由3種單獨(dú)終末途徑轉(zhuǎn)化為苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
增加芳族氨基酸生物合成共同途徑的生產(chǎn)效率的方法包括1992年12月I日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5，168，056、1997年4月I日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5，616，496和1992年12月21日提交且已放棄的U. S. S. N. 07/994194中所述的那些方法，所有這些公開(kāi)通過(guò)引用全文納入本文。
在使用遺傳工程改造的宿主生物體中，指向芳族氨基酸生物合成的碳流可沿著共同途徑進(jìn)行，使DHS的胞內(nèi)水平升高，這是由于芳族氨基酸生物合成共同途徑中阻止DHS轉(zhuǎn)變?yōu)榉种岬耐蛔儭HS作為3-脫氫莽草酸脫水酶(aroZ)的底物，該酶在DHS上的作用產(chǎn)生原兒茶酸鹽。然后原兒茶酸鹽通過(guò)另一已知為原兒茶酸鹽脫羧酶(aroY)的酶轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉Ｒ虼诵纬傻泥彵蕉^而通過(guò)鄰苯二酹I, 2-雙加氧酶(catA)的作用轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸。
從DHS催化順順-粘康酸鹽生物合成的3種酶aroZ、aroY和catA可用重組DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述DNA包括合適啟動(dòng)子控制下的編碼這3種酶的基因。因此碳流可被迫離開(kāi)芳族氨基酸生物合成途徑并進(jìn)入分歧途徑產(chǎn)生順順-粘康酸鹽。因此形成的順順-粘康酸可在胞外培養(yǎng)基中聚集，其可通過(guò)離心、過(guò)濾或其他本領(lǐng)域已知方法分離。然后分離的順順-粘康酸可化學(xué)氫化產(chǎn)生己二酸。
本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，順順-粘康酸鹽產(chǎn)生后可被異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽或反反-粘康酸鹽，二者具有不同的物理特性和化學(xué)反應(yīng)性，可產(chǎn)生與順順-粘康酸鹽不同或以外的用途。例如，順?lè)?異構(gòu)體可比順順-粘康酸鹽具有更高的水和/或有機(jī)介質(zhì)溶解度，具有回收和加工優(yōu)勢(shì)。另一示例中，作為狄爾斯-阿爾德反應(yīng)的反應(yīng)物，反反-異構(gòu)體相比順順-異構(gòu)體具有獨(dú)體的用途。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)順?lè)?粘康酸鹽的方法。所述方法包括提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變(如利用aroZ、aroY和catA酶)產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽；在基本所有順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽的反應(yīng)條件下將順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽；分離順?lè)?粘康酸鹽；和結(jié)晶分離的順?lè)?粘康酸鹽(如作為質(zhì)子化的順?lè)?粘康酸鹽)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)順?lè)?粘康酸鹽的方法。該方法包括提供含從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽的發(fā)酵肉湯；在基本所有順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽的反應(yīng)條件下將順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽；從所述發(fā)酵肉湯中分離順?lè)?粘康酸鹽；和結(jié)晶所述順?lè)?粘康酸鹽。
在另一方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的順?lè)?粘康酸鹽。順?lè)?粘康 酸鹽可回收為鹽，例如無(wú)機(jī)鹽如納粘康酸鹽、鈣粘康酸鹽或銨粘康酸鹽。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)反反-粘康酸鹽的方法，所述方法包括將從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽在基本所有順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽的反應(yīng)條件下異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽。例如，所述異構(gòu)化反應(yīng)可由貴金屬加氫催化劑、海綿金屬加氫催化劑或骨架加氫催化劑催化。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)反反-粘康酸鹽的方法，所述方法包括將從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順?lè)?粘康酸鹽在基本所有順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽的反應(yīng)條件下異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽。例如，所述異構(gòu)化反應(yīng)可由貴金屬加氫催化劑、海綿金屬加氫催化劑或骨架加氫催化劑催化。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的反反-粘康酸鹽(如可再生的反反-粘康酸鹽)。
在另一示例中，本文所述物質(zhì)的任一上述方面、或任一方法、設(shè)備或組合物可包括一種或多種下述特征。
在各種實(shí)施方式中，所述方法包括在含所述可再生碳源的培養(yǎng)基中和在所述可再生碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)镈HS且得到的DHS被生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸鹽的條件下培養(yǎng)表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶(如aroZ)、原兒茶酸鹽脫羧酶(如aroY)和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶(如catA)的重組細(xì)胞。
所述可再生碳源的發(fā)酵生產(chǎn)的順順-粘康酸鹽可產(chǎn)生含所述重組細(xì)胞和胞外順順-粘康酸鹽的肉湯。所述生產(chǎn)還可包括從所述肉湯中分離所述重組細(xì)胞、細(xì)胞碎片、不可溶蛋白和其他不需要的固體，產(chǎn)生含發(fā)酵形成的基本所有或大多數(shù)順順-粘康酸鹽的澄清發(fā)酵肉湯。然后所述順順-粘康酸鹽可在澄清發(fā)酵肉湯中異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽。
在某些實(shí)施方式中，含從可再生碳源通過(guò)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽的發(fā)酵肉湯可提供用于生產(chǎn)順?lè)?粘康酸鹽或反反-粘康酸鹽。所述發(fā)酵肉湯可包括表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的重組細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵肉湯在容器中提供且所述異構(gòu)化反應(yīng)在所述容器中進(jìn)行。所述容器可為發(fā)酵罐容器。在一些示例中，可在含所述可再生碳源的培養(yǎng)基中和在所述可再生碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸且所述3-脫氫莽草酸被生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸鹽的條件下培養(yǎng)表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的重組細(xì)胞。例如，所述重組細(xì)胞可在所述發(fā)酵罐容器中培養(yǎng)，從而產(chǎn)生所述發(fā)酵肉湯。此外，所述重組細(xì)胞可根據(jù)需要從所述發(fā)酵肉湯中移除。
在一些實(shí)施方式中，所述異構(gòu)化反應(yīng)由酸催化。所述酸可為無(wú)機(jī)酸(如礦物酸)或有機(jī)酸。酸可以水合或無(wú)水形式應(yīng)用于所述過(guò)程。在一種示例中，鹽副產(chǎn)物可為硫酸銨，其后續(xù)可用作例如肥料。所述異構(gòu)化反應(yīng)可在約I. 5-約6. 5的pH下進(jìn)行(如I. 5、I. 75、2、
2.25、2. 5、2. 75、3、3. 25、3. 5、3. 75、4、4. 25、4. 5、4. 75、5、5. 25、5. 5、5. 75、6、6. 25、6. 5)。所述異構(gòu)化反應(yīng)優(yōu)選在約3. 5-約4. 5的pH下進(jìn)行。
在一些實(shí)施方式中，所述異構(gòu)化反應(yīng)在約47° C或更高的溫度下進(jìn)行(如47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或更高)。所述異構(gòu)化反應(yīng)優(yōu)選在約60° C或更高的溫度下進(jìn)行。所述異構(gòu)化反應(yīng)可在 8,7. 75,7. 5,7. 25,7,6. 75,6. 5,6. 25,6,5. 75,5. 5,5. 25,5,4. 75,4. 5、
4.25,4,3. 75,3. 5,3. 25,3,2. 75,2. 5,2. 25,2,1. 75,1. 5,1. 25、1、0. 75,0. 5 或 0. 25 小時(shí)內(nèi)基本完成。
在各種實(shí)施方式中，所述異構(gòu)化反應(yīng)基本在順?lè)?粘康酸鹽不從反應(yīng)混合物中沉淀的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述異構(gòu)化反應(yīng)包括監(jiān)控順順-粘康酸鹽向順?lè)?粘康酸鹽的異構(gòu)化。在一些實(shí)施方式中，所述異構(gòu)化反應(yīng)在高于約大氣壓的壓力下進(jìn)行。
在各種實(shí)施方式中，異構(gòu)化后，順?lè)?粘康酸鹽還可通過(guò)足以引起所述順?lè)?粘康酸沉淀的酸化反應(yīng)從所述溶液、培養(yǎng)基、肉湯或發(fā)酵肉湯中分離。所述肉湯可酸化成PH低于約3. 0(如2. 9,2. 8,2. 7,2. 6,2. 5,2. 4,2. 3,2. 2,2. 1、2或更低)。所述肉湯還可酸化成pH低于約2。
在一些實(shí)施方式中，所述分離步驟包括將所述溶液冷卻到低于約37° C、低于約
25。C、低于約-4° C或低于約-20° C的溫度。
在某些實(shí)施方式中，所述分離步驟包括離心、過(guò)濾或其他用于分離所沉淀順?lè)?粘康酸的物理過(guò)程。在各種實(shí)施方式中，所述分離步驟包括用有機(jī)溶劑從所述發(fā)酵肉湯中提取順?lè)?粘康酸鹽。所述有機(jī)溶劑可包含甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氫呋喃、叔丁基甲基醚、甲基四氫呋喃、環(huán)己酮或環(huán)己醇或其混合物中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述提取可在約7-4(如約7、6. 75,6. 5,6. 25,6,5. 75,5. 5、
5.25、5、5. 75、5. 5、5. 25、4)的pH下進(jìn)行，而順?lè)?粘康酸不會(huì)明顯沉淀，并且可包括使用自動(dòng)添加酸以隨著提取進(jìn)行將PH維持在此范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，提取步驟可在低于約4(如約4、3. 75,3. 5,3. 25,3,2. 75,2. 5,2. 25,2)的pH下進(jìn)行，存在沉淀的順?lè)?粘康酸，其可由有機(jī)溶劑溶解。在另一實(shí)施方式中，可進(jìn)行所述提取步驟而不用先從發(fā)酵肉湯中移除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、蛋白或其他不需要的材料。在另一實(shí)施方式中，所述提取步驟可由膜介導(dǎo)。
在某些實(shí)施方式中，順順-粘康酸鹽可先從發(fā)酵肉湯中移除，然后進(jìn)行異構(gòu)化、分離和純化步驟。所述移除可通過(guò)提取、沉淀、離子交換色譜、選擇性膜分離、電滲析或其他本領(lǐng)域已知方法完成。
在一些實(shí)施方式中，順?lè)?粘康酸鹽用有機(jī)溶劑通過(guò)結(jié)晶純化。有機(jī)溶劑可包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氫呋喃中的一種或多種。
在一些實(shí)施方式中，從發(fā)酵肉湯中回收后可進(jìn)行結(jié)晶而不用干燥沉淀的順?lè)?粘康酸。在某些實(shí)施方式中，結(jié)晶包括從分離的順?lè)?粘康酸中移除不需要的鹽。在各種實(shí)施方式中，結(jié)晶包括收集第一批順?lè)?粘康酸后濃縮結(jié)晶培養(yǎng)基以及從該濃縮培養(yǎng)基中收集第二批順?lè)?粘康酸。
在某些實(shí)施方式中，生產(chǎn)反反-粘康酸鹽的方法包括生產(chǎn)順?lè)?粘康酸鹽、將至少約65%的順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽，并分離該反反-粘康酸鹽。本方法可包括將至少約 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反_粘
康酸鹽?；蛘?，反反-粘康酸鹽可由順順-粘康酸鹽在合適的條件下(如pH、溫度、催化劑等)生產(chǎn)或異構(gòu)化。
在各種實(shí)施方式中，所述異構(gòu)化反應(yīng)由I2、貴金屬加氫催化劑、海綿金屬加氫催化劑或骨架加氫催化劑催化。所述貴金屬可為任何有加氫催化劑功能的貴金屬(如鉬、鈀等)。海綿金屬或骨架催化劑可為鎳-招合金(如WRGC公司(W. R. Grace and Company)的RANEY 鎳催化劑)。金屬催化劑可為非均相催化劑(如顆粒)或支持催化劑(如在支持物上如硅、鋁、碳等)的形式。
在一些實(shí)施方式中，提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽使用轉(zhuǎn)化有來(lái)自肺炎桿菌的表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶以及來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的表達(dá)鄰苯二酚1，2_雙加氧酶的異源結(jié)構(gòu)基因的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)以88小時(shí)內(nèi)足以轉(zhuǎn)變至少約I. 38M葡萄糖為至少約0. 42M順順-粘康酸的速率將葡萄糖生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸。所述細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化體可包括表達(dá)3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸鹽合成酶和3-脫氫奎尼酸合成酶的異源DNA序列。所述細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化體可包括表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸鹽合成酶和3-脫氫奎尼酸合成酶的異源DNA序列。所述細(xì)菌細(xì)胞選自具有芳族氨基酸生物合成共同途徑中阻礙3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉种岬耐蛔兊耐蛔兗?xì)胞系。所述細(xì)菌細(xì)胞可選自具有芳族氨基酸生物合成共同途徑中阻礙3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉种岬耐蛔兊耐蛔兗?xì)胞系。
在某些實(shí)施方式中，提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽包括在含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有來(lái)自肺炎桿菌的表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶的酶種類的結(jié)構(gòu)基因以及來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的表達(dá)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶種類的結(jié)構(gòu)基因的細(xì)菌細(xì)胞，通過(guò)3-脫氫莽草酸的生物催化轉(zhuǎn)變以至少約0. 95毫摩爾/升/小時(shí)的速率生產(chǎn)順順-粘康酸，所述碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸。在其他實(shí)施方式中，以至少約0. 97,1. 0,1. 2,1. 4,1. 6,1. 8,2. 0毫摩爾/升/小時(shí)或更快的速率生產(chǎn)順順-粘康酸。
在各種實(shí)施方式中，提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽包括在含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞，通過(guò)3-脫氫莽草酸的生物催化轉(zhuǎn)變以至少約0. 95毫摩爾/升/小時(shí)的速率生產(chǎn)順順-粘康酸，所述細(xì)胞表達(dá)編碼3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶、鄰苯二酚1，2-雙加氧酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸鹽合成酶和3-脫氫奎尼酸合成酶的異源結(jié)構(gòu)基因，碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸。在其他實(shí)施方式中，以至少約0. 97、I. O、I. 2、
I.4、I. 6、I. 8、2. 0毫摩爾/升/小時(shí)或更快的速率生產(chǎn)順順-粘康酸。
在一些實(shí)施方式中，提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽包括在含碳源的培養(yǎng)基中，在所述碳源以至少約0. 95毫摩爾/升/小時(shí)的速率生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有來(lái)自肺炎桿菌的表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶的結(jié)構(gòu)基因以及來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的表達(dá)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的結(jié)構(gòu)基因的細(xì)菌細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，以至少約0. 97,1. 0,1. 2,1. 4,1. 6,1. 8,2. 0毫摩爾/升/小時(shí)或更快的速率生產(chǎn)順順-粘康酸。
由以下對(duì)僅以示例方式說(shuō)明本發(fā)明原理的圖和描述，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
本發(fā)明上述優(yōu)勢(shì)和其他優(yōu)勢(shì)可通過(guò)參考下述說(shuō)明結(jié)合附圖來(lái)更好地理解。所述圖不必定按比例繪制，而強(qiáng)調(diào)一般著重于說(shuō)明本發(fā)明的原理。
圖I顯示芳族氨基酸生物合成共同途徑和從3-脫氫莽草酸合成順順-粘康酸的分歧途徑。
圖2顯示質(zhì)粒p2_47的質(zhì)粒圖并描述如何從質(zhì)粒p2_47、pSUl-31和pSUaroZY157-27 生成質(zhì)粒 pKD8. 243A。
圖3顯示pKD8. 292的質(zhì)粒圖并描述如何從質(zhì)粒pIB1345和pCL1920生成質(zhì)粒pKD8. 292。
圖4A和4B顯示不同培養(yǎng)基中順?lè)?粘康酸的1H NMR光譜的示例。
圖5顯示pH 7時(shí)粘康酸鹽異構(gòu)化反應(yīng)的1H NMR跟蹤的示例。
圖6顯示pH 4時(shí)粘康酸鹽異構(gòu)化反應(yīng)的1H NMR跟蹤的示例。
圖7顯示pH 7時(shí)粘康酸鹽異構(gòu)化反應(yīng)的HPLC跟蹤的示例。
圖8顯示pH 4時(shí)粘康酸鹽異構(gòu)化反應(yīng)的HPLC跟蹤的示例。
圖9顯示pH 7時(shí)粘康酸鹽異構(gòu)化反應(yīng)的時(shí)程的示例。

圖10顯示pH 4時(shí)粘康酸鹽異構(gòu)化反應(yīng)的時(shí)程的示例。
圖11顯示粘康酸的批次培養(yǎng)生產(chǎn)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明包括從能被宿主細(xì)胞利用的可發(fā)酵碳源生產(chǎn)順?lè)?粘康酸和反反-粘康酸的方法，所述細(xì)胞具有芳族氨基酸生物合成共同途徑，例如能通過(guò)中間物DHS發(fā)揮作用，以及表達(dá)酶aroZ、aroY和catA的能力。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法包括步驟存在可發(fā)酵碳源時(shí)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)順順-粘康酸、將所述順順-粘康酸異構(gòu)化產(chǎn)生順?lè)?粘康酸或反反-粘康酸。
可發(fā)酵碳源可主要包括能被生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)榉甲灏被嵘锖铣晒餐緩降膬煞N前體化合物D-赤蘚糖4-磷酸鹽(E4P)和磷酸烯丙醇丙酮酸(PEP)的任何碳源。合適的碳源包括但不限于，生物質(zhì)衍生的或可再生的來(lái)源如淀粉、纖維素和糖部分如葡萄糖、戊糖和果糖，以及能支持微生物代謝的其他碳源如一氧化碳。在一個(gè)實(shí)施方式中，D-葡萄糖可用作生物質(zhì)衍生的碳源。
適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括能用于生物合成生產(chǎn)所需芳族化合物的屬成員。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞適于工業(yè)規(guī)模生物合成生產(chǎn)所需芳族化合物。具體地，合適的宿主細(xì)胞可具有芳族氨基酸生物合成共同內(nèi)源途徑，其至少具有生產(chǎn)DHS的功能。共同芳族途徑在各種微生物中均為內(nèi)源，且可用于生產(chǎn)各種芳族化合物。例如，美國(guó)專利號(hào)5，168，056和5，616，496 (二者的公開(kāi)都通過(guò)引用全文納入本文)中所述的微生物芳族氨基酸生物合成途徑可用于本發(fā)明。
圖I顯示芳族氨基酸生物合成共同途徑和通過(guò)共同芳族途徑從3-脫氫莽草酸合成順順-粘康酸的分歧途徑，所述共同芳族途徑用該途徑中許多中間物引導(dǎo)從E4P和PEP到分支酸。E4P的有效性可通過(guò)tkt基因編碼的磷酸戊糖途徑酶即轉(zhuǎn)酮醇酶增強(qiáng)。該途徑中的中間物包括3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸鹽(DAHP)、3_脫氫奎尼酸(DHQ)、3-脫氫莽草酸(DHS)、莽草酸、莽草酸3-磷酸鹽(S3P)和5-烯醇式丙酮酰莽草酸_3_磷酸鹽(EPSP)。該共同途徑中的酶包括DAHP合成酶(aroF)、DHQ合成酶(aroB)、DHQ脫水酶(aroD)、莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL，aroK)、EPSP合成酶(aroA)和分支酸合成酶(aroC)。
包含該類型共同途徑的宿主細(xì)胞包括屬于下列屬的原核生物埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯菌(Klebsiella)、棒狀桿菌棒狀桿菌(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、節(jié)核細(xì)菌屬(Arthrobacter)、芽抱桿菌(Bacillus)、假單胞 菌(Pseudomonas)、鏈絲菌(Streptomyce)、葡萄球菌(Staphylococcus)和沙雷氏菌屬(Serratia)0也可利用真核宿主細(xì)胞，例如用酵母屬(Saccharomyces)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的酵母。
更具體地，原核宿主細(xì)胞可衍生自包括下述的種，大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)、雙歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)、乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Iactofermentum)^ 黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、地衣芽抱桿菌(Bacillus lichenformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、馬鈴薯?xiàng)U菌(Bacillusmesentericus)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilis)、枯草桿菌(Bacillus subtil is)、綠胺假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、煙草角斑病假單胞菌(Pseudomonas angulata)、焚光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)、煙草假單胞菌(Pseudomonas tabaci)、金素鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)、阿弗鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、春日鏈霉菌(Streptomyces kasugensis)、淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)、利波曼鏈霉菌(Streptomyces Iipmanii)、變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)。原核宿主細(xì)胞的示例包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。
宿主細(xì)胞可包括具有阻斷DHS轉(zhuǎn)變?yōu)榉种c(diǎn)分子即分支酸的突變營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變細(xì)胞系。該突變體由于編碼莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、EPSP合成酶和分支酸合成酶的一種或多種基因中的突變而不能催化3-脫氫莽草酸(DHS)轉(zhuǎn)變?yōu)榉种?，因此?huì)聚集更高胞內(nèi)水平的DHS。該突變細(xì)胞系的示例包括大腸桿菌株系A(chǔ)B2834、AB2829和AB2849。
大腸桿菌(E. coli)AB2834由于編碼莽草酸脫氫酶的aroE基因座的突變而不能催化3-脫氫莽草酸(DHS)轉(zhuǎn)變?yōu)槊Р菟?。使用大腸桿菌AB2834能確保導(dǎo)向芳族氨基酸生物合成的碳流不會(huì)處理超出DHS。相似地，大腸桿菌AB2829 (由于編碼EPSP合成酶的aroA基因座的突變而不能催化莽草酸3-磷酸鹽(S3P)轉(zhuǎn)變?yōu)?-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸鹽(EPSP))且大腸桿菌AB2849(由于編碼分支酸合成酶的aroC基因座的突變而不能催化EPSP轉(zhuǎn)變?yōu)榉种?也使DHS胞內(nèi)水平提高。
宿主細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化，從而胞外DHS可用作生物催化轉(zhuǎn)變成鄰苯二酚的底物，然后可被轉(zhuǎn)化為粘康酸。例如，宿主細(xì)胞可用重組DNA轉(zhuǎn)化，迫使碳流在產(chǎn)生DHS后遠(yuǎn)離芳族氨基酸生物合成共同途徑并進(jìn)入生產(chǎn)粘康酸的途徑。
如圖I所示，分歧途徑中的中間物是原兒茶酸鹽、鄰苯二酚和順順-粘康酸。負(fù)責(zé)將DHS生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)樵瓋翰杷猁}的酶是3-脫氫莽草酸脫水酶，圖I中標(biāo)記為“aroZ”。負(fù)責(zé)原兒茶酸鹽脫羧作用形成鄰苯二酚的酶是原兒茶酸鹽脫羧酶，圖I中標(biāo)記為“aroY”。最后，催化鄰苯二酚氧化產(chǎn)生順順-粘康酸的酶是鄰苯二酚1，2-雙加氧酶，圖I中標(biāo)記為“aroA”。按照標(biāo)準(zhǔn)注釋，表達(dá)這些酶的基因用斜體字分別表示為ar0Z、ar0Y和catA。然后順順-粘康酸可被異構(gòu)化(未顯示)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可組成型表達(dá)基·因aroZ、aroY和catA。在另一實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可組成型表達(dá)基因aroZ、aroY和catA中任何一種或多種；或其二者的任意組合。在另一實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可均不組成型表達(dá)aroZ、aroY 和 catA。
3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶從鄰位切割途徑募集，其能使微生物如脈孢菌(Neurospora)、黑麴菌屬(Aspergillus)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、克雷伯菌(Klebsiella)和假單胞菌(Pseudomonas)使用芳族(苯甲酸和對(duì)輕基苯甲酸鹽)以及氫化芳族(莽草酸和奎尼酸)作為碳源用于生長(zhǎng)。DHS脫水酶在奎寧酸和莽草酸的微生物分解代謝中有重要作用。在產(chǎn)氣克氏桿菌(Klebsiella aerogenes)的對(duì)羥基苯甲酸鹽分解代謝期間，原兒茶酸鹽脫羧酶用Patel制備用以催化原兒茶酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉印atel株系(現(xiàn)在稱為產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes))的復(fù)查[(a) Grant, D. J. ff. ; Patel, J.C. Antonie van Leewenhoek 1969,35,325. (b)Grant, D. J. ff. Antonievan Leewenhoek1970，36，161]近期引導(dǎo)Ornston總結(jié)出原兒茶酸鹽脫羧酶在對(duì)羥基苯甲酸鹽的分解代謝中并非為代謝上重要[Doten, R. C. ; Ornston, N. J. Bacteriol. 1987，169，5827]。
轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞使碳流導(dǎo)向分歧途徑的機(jī)制可涉及插入遺傳元件，包括編碼3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的可表達(dá)序列。無(wú)論所用的確切機(jī)制，預(yù)期這些酶活性的表達(dá)會(huì)受到遺傳元件轉(zhuǎn)移到所述宿主細(xì)胞的影響或介導(dǎo)。本文定義的遺傳元件包括可表達(dá)編碼序列的核酸(通常DNA和RNA)，用于產(chǎn)物例如蛋白、脫輔基蛋白或反義RNA，其可進(jìn)行或控制途徑酶功能。表達(dá)的產(chǎn)物可用作酶、抑制或去抑制酶活性、或控制酶的表達(dá)。編碼這些可表達(dá)序列的核酸可為染色體的(如插入或整合到宿主染色體中)或染色體外(如由質(zhì)粒、粘粒攜帶等)。
本發(fā)明的遺傳元件可通過(guò)質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、酵母人工染色體或介導(dǎo)所述遺傳元件轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的其他載體來(lái)引入宿主細(xì)胞。這些載體可包含沿著順式作用對(duì)照元件的復(fù)制起點(diǎn)，其控制所述載體和該載體所攜帶遺傳元件的復(fù)制。選擇標(biāo)記可存在于載體上以用于幫助鑒定已引入所述遺傳元件的宿主細(xì)胞。例如，選擇標(biāo)記可為賦予對(duì)具體抗生素如四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素或新霉素的抗性的基因。
將遺傳元件引入宿主細(xì)胞可利用已插入遺傳元件的染色體外多拷貝質(zhì)粒載體。由質(zhì)粒承擔(dān)的將所述遺傳元件引入宿主細(xì)胞包括先用限制性酶切割質(zhì)粒，然后連接質(zhì)粒和本發(fā)明所述的遺傳元件。連接的重組質(zhì)粒重新環(huán)化后，用轉(zhuǎn)導(dǎo)或其他質(zhì)粒轉(zhuǎn)移機(jī)制(如電穿孔、微注射等)將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述宿主細(xì)胞。適于將遺傳元件插入所述宿主細(xì)胞的質(zhì)粒包括但不限于PBR322和其衍生物如pAT153、pXf3、pBR325、pBr327, pUC載體，pACYC和其衍生物，pSClOl和其衍生物和ColEl。此外，粘粒載體如pLAFR3也適于將遺傳元件插入宿主細(xì)胞。質(zhì)粒構(gòu)建體的示例包括但不限于p2-47、pKD8. 243A、pKD8. 243B和pSUaroZY157_27，其帶有分離自肺炎桿菌的aroZ和aroY基因座，分別編碼3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶。質(zhì)粒構(gòu)建體的其他示例包括PKD8. 292，其載有乙酸鈣不動(dòng)桿菌catA的內(nèi)源遺傳片段，編碼鄰苯二酌' I, 2-雙加氧酶。
轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法還可包括插入編碼增加碳進(jìn)入芳族氨基酸生物合成共同途徑的酶的基因?；虻谋磉_(dá)主要由其自身啟動(dòng)子指導(dǎo)，盡管包括任選表達(dá)控制序列如抑制子和增強(qiáng)子的其他遺傳元件也可包括在內(nèi)以控制表達(dá)或去抑制蛋白、脫輔基蛋白或反義RNA的編碼序列。此外，可生成重組DNA構(gòu)建體，其中所述基因的天然啟動(dòng)子用替代的啟動(dòng)子取代以增加基因產(chǎn)物表達(dá)。啟動(dòng)自可為組成型或誘導(dǎo)型。組成型啟動(dòng)子在細(xì)胞周期中以恒定速率控制基因轉(zhuǎn)錄，而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性波動(dòng)由存在(或缺失)特異誘導(dǎo)劑所確定。例如，控制序列可插入野生型宿主細(xì)胞以促進(jìn)宿主細(xì)胞基因組已編碼的所選酶的過(guò)表達(dá)， 或這可用于控制染色體外編碼酶的合成。
可使用促進(jìn)DHS過(guò)表達(dá)的控制序列。如前所述，DHS在共同途徑中通過(guò)3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸鹽(DAHP)合成酶(aroF編碼)的酪氨酸敏感的同工酶和3-脫氫奎尼酸(DHQ)合成酶(aroB編碼)以及磷酸戊糖途徑酶轉(zhuǎn)酮醇酶(tkt編碼)順序催化活性合成。這些生物合成酶的表達(dá)可擴(kuò)增以增加D-葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈HS。共同途徑的第一個(gè)酶即DAHP合成酶的體內(nèi)催化劑活性增加使等價(jià)D-葡萄糖流導(dǎo)入芳族生物合成。然而，達(dá)到DAHP合成酶催化活性的水平，除此之外負(fù)責(zé)芳族合成的D-葡萄糖百分比上沒(méi)有實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步改良。在該限制水平的芳族氨基酸生物合成下，磷酸戊糖途徑酶轉(zhuǎn)酮醇酶的催化水平擴(kuò)大可實(shí)現(xiàn)流入該途徑的D-葡萄糖百分比大量增加。
擴(kuò)大的轉(zhuǎn)酮醇酶活性可增加D-赤蘚糖4-磷酸鹽的濃度。作為DAHP合成的兩種底物之一，受限的D-赤蘚糖4-磷酸鹽有用性會(huì)限制DAHP合成酶的催化活性。因此，擴(kuò)大DAHP合成酶、DHQ合成酶和DHQ脫水酶的催化活性的一種方法是通過(guò)用編碼這些酶的重組DNA序列轉(zhuǎn)化微生物催化劑來(lái)過(guò)表達(dá)酶種類。
擴(kuò)增DAHP合成酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的表達(dá)可產(chǎn)生流入芳族氨基酸生物合成共同途徑的大量碳流，超出進(jìn)入該途徑的正常碳流。若芳族氨基酸共同途徑中個(gè)體酶催化的底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的個(gè)體速率低于DAHP合成速率，這些速率限制酶的底物可在胞內(nèi)聚集。
微生物如大腸桿菌通常通過(guò)將底物運(yùn)出到外部環(huán)境如大量發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)處理聚集的底物。這會(huì)導(dǎo)致通過(guò)所述共同途徑的碳流損失，因?yàn)檫\(yùn)出的底物通常不再屬于微生物代謝。DHQ合成酶是速率限制的共同途徑酶的示例。DHQ合成酶的擴(kuò)增表達(dá)消除該酶的速率限制特征，并阻止DAHP和其非磷酸化類似物DAH的聚集。DHQ脫水酶非速率限制型。因此，aroF-編碼的DAHP合成酶、tkt-編碼的轉(zhuǎn)酮醇酶和aroB-編碼的DHQ合成酶的擴(kuò)增表達(dá)增加DHS的生產(chǎn)，其在DHS脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶存在時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉樱缓笊锎呋D(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸，然后其可被異構(gòu)化。
能促進(jìn)碳流沿著碳源和DHS之間共同途徑的效率的一種質(zhì)粒是質(zhì)粒pKD136，其編碼aroF、tkt和aroB基因。由于DAHP合成酶(aroF編碼)和轉(zhuǎn)酮醇酶(tkt編碼)的擴(kuò)增表達(dá)，質(zhì)粒PKD136將大量碳流導(dǎo)向芳族生物合成。然后由于DHQ合成酶(aroB編碼)的擴(kuò)增表達(dá)，所述大量碳流通過(guò)PKD136完整導(dǎo)入DHS合成。
因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，構(gòu)建表達(dá)編碼DHS脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶、和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶基因的大腸桿菌異源株系，使D-葡萄糖生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸。D-葡萄糖有效轉(zhuǎn)變?yōu)镈HS在pKD136轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)。然后用質(zhì)粒pKD8. 243A和pKD8. 292轉(zhuǎn)化株系大腸桿菌株系A(chǔ)B2834/pKD136。得到表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶(aroZ)、原兒茶酸鹽脫羧酶(aroY)和鄰苯二酹I, 2-雙加氧酶(catA)的大腸桿菌AB2834/pKD136/pKD8. 243A/pKD8. 292。該細(xì)菌細(xì)胞系于1995年8月I日保藏在馬里蘭州羅克維爾帕克曼12301 (12301Parklawn Drive, Rockville, MD)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection),登錄號(hào) 69875。
在另一實(shí)施方式中，大腸桿菌AB2834/pKD136用質(zhì)粒p2_47和pKD8. 292轉(zhuǎn)化，生成大腸桿菌AB2834/pKD136/p2-47/pKD8. 292。在另一實(shí)施方式中，大腸桿菌AB2834/PKD136 用質(zhì)粒 pKD8. 243B 和 pKD8. 292 轉(zhuǎn)化，生成大腸桿菌 AB2834/pKD136/p2_47/ pKD8. 292。這些異源宿主細(xì)胞系各催化D-葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸。合成的順順-粘康酸在胞外聚集且可從細(xì)胞中分離。然后，順順-粘康酸可異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸以及進(jìn)一步成為所需的反反-粘康酸。
因此本發(fā)明涉及具有芳族氨基酸生物合成共同內(nèi)源途徑的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化體的特征為組成型表達(dá)編碼3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的異源基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化體還用編碼轉(zhuǎn)酮醇酶、DAHP合成酶和DHQ合成酶的可表達(dá)重組DNA序列轉(zhuǎn)化。在另一實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞選自突變細(xì)胞系組，所述突變細(xì)胞系組包括具有芳族氨基酸生物合成共同途徑中具有阻礙3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉种岬耐蛔?。在另一?shí)施方式中，編碼3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶的基因?yàn)榉窝讞U菌內(nèi)源。在另一實(shí)施方式中，編碼鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的異源基因?yàn)橐宜徕}不動(dòng)桿菌內(nèi)源。
可再生粘康酸鹽
產(chǎn)自可再生、生物衍生碳源的粘康酸由來(lái)自可被植物納入的空氣二氧化碳的碳組成(如來(lái)自諸如葡萄糖、蔗糖、甘油或植物油等碳源)。因此，該粘康酸的分子結(jié)構(gòu)中包括可再生碳而不是基于化石燃料或基于石油的碳。因此，作為本專利主題的生物合成粘康酸鹽和相關(guān)的衍生產(chǎn)物，比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的粘康酸鹽和相關(guān)產(chǎn)物具有更小的碳足跡，因?yàn)槠洳幌幕剂匣蚴蛢?chǔ)存且因?yàn)槠洳辉黾犹佳h(huán)中的碳量(如生命周期分析顯示對(duì)全球碳平衡沒(méi)有凈碳增加)。
生物合成的粘康酸鹽和相關(guān)產(chǎn)物可與化石燃料或石油化學(xué)碳源生產(chǎn)的粘康酸鹽和相關(guān)產(chǎn)物相區(qū)分，通過(guò)本領(lǐng)域已知方法如雙碳-同位素指印。本方法可區(qū)分化學(xué)上相同的材料，并用14C和13C同位素比例根據(jù)來(lái)源區(qū)分材料中的碳原子，即生物對(duì)比非生物。碳原子同位素14C不穩(wěn)定，半衰期為5730年。測(cè)量不穩(wěn)定14C同位素相對(duì)于穩(wěn)定同位素13C的相對(duì)豐度能區(qū)分化石(長(zhǎng)期死亡)和生物圈(活的因此可再生)原料之間的樣本碳(參見(jiàn)Currie, L. A. “Source Apportionment of Atmospheric Particles,’’Characterization ofEnvironmental Particles,(“大氣顆粒的來(lái)源解析，”環(huán)境顆粒鑒定)J. Buffle和H. P. vanLeeuwen 編，IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (《IUPAC 環(huán)境分析化學(xué)系列》)第I卷第I部分(路易斯出版社公司(Lewis Publishers, Inc) ) (1992) 3-74)。放射性碳數(shù)據(jù)中的基本假設(shè)是14C濃度在大氣中的恒定導(dǎo)致14C在活生物體中恒定。
處理分離樣品時(shí)，樣品年齡可通過(guò)關(guān)系式t=(_5730/0. 693) In (A/A。)近似推測(cè)，其中t=年齡，5730年是不穩(wěn)定14C同位素的半衰期，且A和A。分別是樣品和現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)的特異14C 活性(Hsieh, Y.，Soil ScL Soc. Am J.，56，460，(1992))。然而，由于 1950 年開(kāi)始的大氣核測(cè)試和1850年開(kāi)始燃燒化石燃料，14C獲得第二地理化學(xué)時(shí)間特征。其在大氣CO2中的濃度以及因此在或生物圈中的濃度在20世紀(jì)60年代中期核測(cè)試頂峰時(shí)近似翻倍。然后其逐漸恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)宇宙發(fā)生(大氣)的基線同位素率(14C/12C)-約1.2x 10_12，近似松弛半衰期為7-10年。(后一種半衰期需與同位素半衰期區(qū)分，即必須使用詳細(xì)的大氣核輸入/衰退函數(shù)來(lái)示蹤核時(shí)代發(fā)生以來(lái)大氣和生物圈14C的變化。)正是這后一種生物圈14C時(shí)間特征使近期生物圈碳能保持每年測(cè)定。14C可通過(guò)加速器質(zhì)譜(AMS)來(lái)測(cè)量，結(jié)果以現(xiàn)代碳部分的單位給出。fM由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology (NIST))標(biāo)準(zhǔn)參考材料(Standard Reference Materials (SRM) )4990B 和 4990C定義，分別稱為草酸標(biāo)準(zhǔn)HOxI和HOxII?；A(chǔ)定義涉及0. 95倍的14C/12C同位素比HOxI(參考AD1950)。對(duì)于當(dāng)前活生物圈(植物材料)，fM ^ I. I。
穩(wěn)定碳同位素13C和12C的比例提供了來(lái)源區(qū)分和分配的補(bǔ)充途徑。給定生物來(lái)源材料中的13c/12c是二氧化碳被固定時(shí)大氣二氧化碳中13c/12c比例的結(jié)果，并且還反映了精確的代謝途徑。還發(fā)生地區(qū)變化。石油、C3植物(闊葉植物)、植物(禾本科)和海洋碳酸鹽都顯示出在13c/12c和相應(yīng)的S13C值方面的顯著不同。此外，代謝途徑的結(jié)果是，C3和C4植物的脂類物質(zhì)與衍生自相同植物糖組分的材料進(jìn)行不同的分解。測(cè)量精度內(nèi)，由于同位素分餾效應(yīng)，13C顯示較大的變化，其對(duì)本發(fā)明最重要的是光合作用機(jī)制。植物中碳同位素比例差異的主要原因是與植物光合作用碳代謝途徑的差異相關(guān)，尤其是主要羧化反應(yīng)期間發(fā)生的反應(yīng)(如空氣CO2的初始固定)。兩大類植物是將C3 (或卡爾文-本森(Calvin-Benson))光合循環(huán)納入的那些和將C4(或哈奇-斯萊克(Hatch-Slack))光合循環(huán)納入的那些。C3植物如闊葉樹(shù)和針葉樹(shù)主要在溫帶氣候帶。C3植物中，主要CO2固定或羧化反應(yīng)涉及核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶，第一個(gè)穩(wěn)定產(chǎn)物是3碳化合物。另一方面，C4植物包括諸如熱帶針葉樹(shù)、玉米和甘蔗等植物。C4植物中，涉及另一酶即磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的其他羧化反應(yīng)是主要的羧化反應(yīng)。第一穩(wěn)定碳化合物是4碳酸，然后其被去羧化。因此釋放的CO2被C3循環(huán)再固定。
C4和C3植物都顯示13C/12C同位素比例范圍，但通常值為每密耳約-10 -14 (C4)和每密耳-21 -26 (C3) (Weber 等 J. Agric. Food Chem. , 45, 2942 (1997))。煤和石油通常落入后者的范圍。13C測(cè)量尺度原始定義為由國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pee dee belemnite (F1DB)石灰石設(shè)定的零，其中數(shù)值以此材料的千分率偏差給出。S 13C值為千分之幾(每密耳)，縮寫(xiě)為 %o，按如下計(jì)算8 13C = (13C/12C)樣品-(13C/12C)標(biāo)準(zhǔn) /(13C/12C)標(biāo)準(zhǔn) X 1000%。
由于PDB參考材料(RM)已經(jīng)耗盡，IAEA、USGS, NIST和其他選定國(guó)際同位素實(shí)驗(yàn)室已聯(lián)合開(kāi)發(fā)一系列替代的RM。PDB的每密耳偏差注釋為S13C。通過(guò)高精度穩(wěn)定比值質(zhì)譜(IRMS)在分子離子質(zhì)量44、45和46下對(duì)CO2進(jìn)行測(cè)量。
因此，生物合成的粘康酸鹽和包括生物合成粘康酸鹽的組合物可與其基于14C(f )和雙碳-同位素指紋的化石燃料和石油衍生的相對(duì)物相區(qū)分，表明其為新的物質(zhì)組合物(如美國(guó)專利號(hào)7，169，588,7, 531，593和6，428，767)。區(qū)別這些產(chǎn)物的能力有益于在商業(yè)上跟蹤這些材料。例如，含新和舊碳同位素分布的產(chǎn)品可與僅用舊材料制作的產(chǎn)品區(qū)分。因此，生物合成粘康酸鹽和衍生材料可在商業(yè)上基于其獨(dú)特的分布而跟蹤。
實(shí)施例
實(shí)施例I-克隆aroZ基因
編碼DHS脫水酶的基因稱為aroZ，從肺炎桿菌DNA基因組庫(kù)中分離?；蚪MDNA從肺炎桿菌株系A(chǔ)170-40中純化且部分用BamHI消化產(chǎn)生15kb_30kb的片段。得到的DNA片段連接到粘粒PLAFR3中，其先用BamHI消化然后用小牛腸堿性磷酸酶處理。pLAFR3是具有RK2復(fù)制子的四環(huán)素抗性粘粒。連接的DNA用Packagene包裝系統(tǒng)(普洛麥格(Promega))包裝，且得到的噬菌體顆粒用于感染大腸桿菌DH5a /PKD136。質(zhì)粒pKD136是含編碼轉(zhuǎn)酮醇酶(tkt)、DAHP合成酶(aroF)和DHQ合成酶(aroB)的基因以及氨芐青霉素抗性基因的基 于PBR325的載體(pMBl復(fù)制起點(diǎn))。然后將對(duì)四環(huán)素和氨芐青霉素都有抗性的菌落置于顯色極限培養(yǎng)基(M9)平板上，所述培養(yǎng)基板含D-葡萄糖(4g L)、莽草酸(0. 04g L)、檸檬酸鐵(0. 07g L)、對(duì)甲苯胺(1.9g L)、氨芐青霉素(0.05g L)和四環(huán)素(0. 013g L)。37° C孵育48小時(shí)后，菌落5-87周圍的生長(zhǎng)培養(yǎng)基顯示為棕色，與原兒茶酸點(diǎn)在板上時(shí)培養(yǎng)基發(fā)生暗化類似。從菌落5-87的培養(yǎng)物中純化DNA，由pKD136和四環(huán)素抗性粘粒組成，稱為p5_87。粘粒p5-87含有14kb BamH I片段，其用BamH I消化完全時(shí)產(chǎn)生四種可檢測(cè)DNA片段。
實(shí)施例2 -確認(rèn)aroZ基因的克隆
確認(rèn)粘粒p5_87含有aroZ基因依賴于通常將D-葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈HS的大腸桿菌株系的轉(zhuǎn)化，其可進(jìn)一步將DHS轉(zhuǎn)變?yōu)樵瓋翰杷?。由于編碼莽草酸脫氫酶的aroE基因的突變，大腸桿菌AB2834在培養(yǎng)物上清中聚集DHS。D-葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈HS在AB2834轉(zhuǎn)化有PKD136時(shí)達(dá)到最大化。AB2834用pKD136和p5_87共轉(zhuǎn)化產(chǎn)生對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素有抗性的菌落。I升LB培養(yǎng)基(4L錐形瓶)用AB2834/pKD136/p5-87的過(guò)夜培養(yǎng)物(5mL)接種。所述培養(yǎng)物37° C振蕩(250rpm)生長(zhǎng)8小時(shí)。然后收獲細(xì)胞并在I升(4L錐形瓶)基本M9培養(yǎng)基中重懸，所述培養(yǎng)基含有葡萄糖(10g L)、莽草酸(0.04g L)、氨芐青霉素(0.05gL)和四環(huán)素(0. 013g L)。培養(yǎng)物返回37° C孵育。24小時(shí)和64小時(shí)后移出等分培養(yǎng)物，離心移除細(xì)胞。從各樣品中收集5毫升分離上清并真空移除水。樣品再溶于D2O中并真空濃縮。重復(fù)該過(guò)程，使殘余水與D2O交換，產(chǎn)生適于1H NMR分析的樣品。用3-(三甲基甲硅烷基)丙酸_2，2，3，3-d4酸的鈉鹽作為內(nèi)標(biāo)，確定約9mM原兒茶酸聚集在培養(yǎng)物上清中。6 6. 94 (d, 7Hz，1H)和6 7. 48 (d, 7Hz，2H)的診斷共振指示原兒茶酸。DHS未在所述培養(yǎng)物上清中檢測(cè)到。從本實(shí)驗(yàn)推斷出編碼DHS脫水酶(aroZ)的基因定位在質(zhì)粒p5_87上。
實(shí)施例3 -亞克隆aroZ基因
為了使編碼aroZ的插入物尺寸最小化,用BamH I消化質(zhì)粒p5_87,得到的片段連接到前面用BamH I消化并用磷酸酶處理的載體pSU19上。質(zhì)粒pSU19含pl5A復(fù)制子和影響賦予氯霉素抗性的基因。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a /pKD136中后，得到的氨芐青霉素和氯霉素抗性菌落如實(shí)施例I所述就將含檸檬酸鐵和對(duì)甲苯胺的顯色極限培養(yǎng)基瓊脂糖平板變?yōu)樽厣哪芰Y選。使用該技術(shù)，分離到質(zhì)粒PSU1-31，其由pSU19所含的3. 5kbBamHI插入物組成。AB2834/pKD136/pSUl_31生長(zhǎng)在與實(shí)施例I所述條件相似的IL規(guī)模中，培養(yǎng)物上清的1H NMR分析表明IlmM原兒茶酸在胞外聚集。[0096]實(shí)施例4-克隆aroY基因
分離含aroY基因的DNA片段是基于正常合成原兒茶酸鹽的株系會(huì)在催化活性的原兒茶酸鹽脫羧酶存在時(shí)轉(zhuǎn)而合成鄰苯二酹。制備含位于pLAFR3中3. 5kb BamH I aroZ片段的粘粒P4-20。在粘粒p4-20中制備用EcoR I消化的肺炎桿菌DNA庫(kù)，類似先前在PLAFR3中的構(gòu)建。包裝在入噬菌體頭中的DNA用于感染大腸桿菌DH5 a /pKD136，產(chǎn)生對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素有抗性的菌落。在含檸檬酸鐵和對(duì)甲苯胺的顯色極限培養(yǎng)基瓊脂糖平板中篩選菌落。由于添加鄰苯二酚到顯色極限培養(yǎng)基中比添加等量原兒茶酸產(chǎn)生更強(qiáng)的周圍瓊脂糖暗化，所以預(yù)期合成鄰苯二酚的那些菌落可從合成原兒茶酸鹽的菌落背景中篩選出來(lái)。37° C孵育約24小時(shí)后，菌落2-47產(chǎn)生所有其他菌落都沒(méi)有的棕色局部區(qū)域。
從菌落2-47中分離DNA產(chǎn)生質(zhì)粒pKD136和質(zhì)粒p2_47，然后其共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中產(chǎn)生大腸桿菌AB2834/pKD136/p2-47。AB2834/pKD136/p2_47的培養(yǎng)物上清如實(shí)施例2所述通過(guò)1H NMR分析。極限培養(yǎng)基中48小時(shí)后，56mM D-葡萄糖溶液被AB2834/pKD136/P2-47轉(zhuǎn)變?yōu)?0mM鄰苯二酚溶液。
實(shí)施例5-亞克隆aroY基因
與分離編碼原兒茶酸鹽脫羧酶的DNA原始策略類似，將aroYEcoR I片段以其最小尺寸亞克隆也依賴于存在DHS脫水酶時(shí)aroE宿主菌株的鄰苯二酚合成。p2_47用EcoRI消化完全表明aroY插入物由兩個(gè)約8kb和11. 9kb的EcoR I片段組成。11. 9kb EcoR I片段定位在pSUl-31中會(huì)產(chǎn)生質(zhì)粒pSUaroZY157-27。在實(shí)施例2所述的相似條件下于IL規(guī)模中培養(yǎng)時(shí)，大腸桿菌AB2834/pKD136/pSUaroZY157-27在補(bǔ)充有56mM D-葡萄糖的培養(yǎng)物上清中聚集16mM鄰苯二酚。11.9kb EcoR I片段結(jié)合其他亞克隆的作圖表明aroY基因可能定位在11. 9kb片段中部附近。用Hind III消化pSUaroZY157-27產(chǎn)生2. 3kb HindIII片段，將其插入pSUl-31中產(chǎn)生質(zhì)粒pKD8. 243A(圖2)。還分離質(zhì)粒pKD8. 243B，其中
2.3kb Hind III片段位于相對(duì)所述載體的反向。這些質(zhì)粒各共轉(zhuǎn)化到含質(zhì)粒pKD136的AB2834中。在實(shí)施例2所述的相似條件下于IL規(guī)模中培養(yǎng)時(shí)，AB2834/pKD136/pKD8. 243A在48小時(shí)內(nèi)從56mMD-葡萄糖合成16mM鄰苯二酚，而AB2834/pKD136/pKD8. 243B合成IOmM鄰苯二酚。還在一些培養(yǎng)物上清中檢測(cè)到原兒茶酸(<4mM)，盡管并非一致的基礎(chǔ)且不是總在微生物合成的末端。表達(dá)酶種類3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶的細(xì)菌細(xì)胞系A(chǔ)B2834/pKD136/pKD8. 243A于1996年3月19日保藏于馬里蘭州羅克維爾帕克曼12301 (12301Parklawn Drive, Rockville, MD)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection),登錄號(hào) 98014。
實(shí)施例6鄰苯二酚1，2-雙加氧酶在生物體中的表達(dá)能催化D-葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉?，預(yù)期引起微生物合成順順-粘康酸。獲得含宿主載體PUC19所提供Iac啟動(dòng)子表達(dá)的乙酸鈣不動(dòng)桿菌catA基因的質(zhì)粒pIB 1345。設(shè)計(jì)三種質(zhì)粒系統(tǒng)用于從D-葡萄糖微生物合成順順-粘康酸鹽。發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒PKD136 (pMBl起點(diǎn)，氨芐青霉素抗性)和pKD8. 243A(pl5A起點(diǎn)，氯霉素抗性)在所用生長(zhǎng)條件下穩(wěn)定維持。選擇第三種質(zhì)粒PCL1920用于表達(dá)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶。質(zhì)粒pCL1920是含有pSClOl復(fù)制起點(diǎn)和賦予壯觀霉素抗性的基因的低拷貝載體。用Sal I和Kpn I消化pIB1345產(chǎn)生I. 5kb片段，然后其被定位到pCL1920中產(chǎn)生pKD8. 292(圖3)，其中鄰苯二酚1，2-雙加氧酶從編碼Iac啟動(dòng)子的載體中表達(dá)。用pKD8. 243A和pKD8. 292轉(zhuǎn)化AB2834/pKD136產(chǎn)生對(duì)氨芐青霉素、氯霉素和壯觀霉素有抗性的菌落。
測(cè)定酶活性以確認(rèn)大腸桿菌AB2834/pKD136/pKD8. 243A/pKD8. 292表達(dá)將DHS轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸鹽必需的來(lái)自鄰位切割途徑的各基因。AB2834/pKD136/pKD8. 243A/PKD8. 292的培養(yǎng)物在含IPTG (0. 2mM)、氨芐青霉素(0. 05g)、氯霉素(0. 02g)和壯觀霉素(0. 05g)的 LB 中(IL) 250rpm，37° C 培養(yǎng) 10 小時(shí)。收獲細(xì)胞并在 IOOmM Tris HCl、pH7.5、2.5mM MgCl2中重懸。經(jīng)過(guò)兩次弗氏(French)壓細(xì)胞壓碎器(16，OOOpsi)后，裂解物通過(guò)離心澄清(40000g，30分鐘，4° C)。為了測(cè)定DHS脫水酶活性，各實(shí)驗(yàn)包含(終體積ImL) IOOmM Tris HCl，pH 7. 5, 25mM MgCl2, mM DHS 和細(xì)胞裂解物。添加 DHS 后，原兒茶酸鹽(e =389(^0111)的形成在 290nm 處監(jiān)控?cái)?shù)分鐘。測(cè)量的 3 種 AB2834/pKD 136/pKD8. 243A/PKD8-292樣品的DHS脫水酶活性測(cè)定為0. 078單位毫克±0. 009，其中一個(gè)單位是在I分 鐘內(nèi)將I U mo I DHS轉(zhuǎn)變?yōu)樵瓋翰杷崴璧拿噶俊?br>鄰苯二酚1，2-雙加氧酶特異活性用上述生產(chǎn)的相同細(xì)胞裂解物樣品測(cè)定。各試驗(yàn)含有IOOmM磷酸鉀、pH 7. 5，0. 2mM鄰苯二酚和細(xì)胞裂解物。通過(guò)跟蹤260nm處吸光度的增加來(lái)監(jiān)控順順-粘康酸鹽的形成。假定試驗(yàn)條件下順順-粘康酸鹽和鄰苯二酚之間的摩爾消光系數(shù)差異為16，OOOM1Cm1,測(cè)定AB2834/pKD136/pKD8. 243A/PKD8-292中的鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活性為0. 25單位毫克±0. 0，其中一個(gè)單位對(duì)應(yīng)于每分鐘的I ii mol順順-粘康酸鹽形成。
為了測(cè)定原兒茶酸鹽脫羧酶的活性，如前實(shí)施例6所述培養(yǎng)AB2834/pKD 136/pKD8. 243A/pKD8. 292。收獲細(xì)胞并在75mM pH 7. I磷酸緩沖液中重懸。經(jīng)過(guò)弗氏(French)細(xì)胞壓碎器(16000psi)破碎后，裂解物通過(guò)離心澄清(40000g，30分鐘，4° C)。通過(guò)跟蹤原兒茶酸的消耗來(lái)測(cè)定原兒茶酸脫羧酶活性。各試驗(yàn)(終體積ImL)含75mM磷酸鈉、pH
6.0,0. 3mM原兒茶酸和細(xì)胞裂解物。監(jiān)控290nm吸光度隨著時(shí)間的損失。AB2834/pKD136/pKD8. 243A/pKD8. 292中原兒茶酸脫羧酶活性測(cè)定為0. 028單位毫克±0. 009，其中一個(gè)單位對(duì)應(yīng)于每分鐘的I U mo I原兒茶酸氧化。
實(shí)施例7用大腸桿菌AB2834/pKD136/pKD8. 243A/pKD8. 292從D-葡萄糖微生物合成順順-粘康酸鹽如下進(jìn)行。含IPTG (0. 2mM)、氨芐青霉素(0. 05g)、氯霉素(0. 02g)和壯觀霉素(0. 05g) I 升 LB 培養(yǎng)基(4L 錐形燒瓶中)用 10mLAB2834/pKD136/pKD8. 243A/pKD8. 292過(guò)夜培養(yǎng)物接種。細(xì)胞在250rpm 37° C培養(yǎng)10小時(shí)。收獲細(xì)胞，在含56mM D-葡萄糖、莽草酸(0. 04g)、IPTG(0. 2mM)、氨芐青霉素(0. 05g)、氯霉素(0. 02g)和壯觀霉素(0. 05g)的IL M9基本培養(yǎng)基中重懸。培養(yǎng)物返回37° C孵育。在基本培養(yǎng)基中重懸后，密切監(jiān)控培養(yǎng)物的PH，尤其是初始12小時(shí)。培養(yǎng)物pH達(dá)到6. 5時(shí)，加入5N NaOH將pH調(diào)回約6. 8。48小時(shí)聚集期間，培養(yǎng)物pH不能低于6. 3。基本培養(yǎng)基中24小時(shí)后，用實(shí)施例2所述的方法在培養(yǎng)物上清中檢測(cè)到12mM順順-粘康酸鹽和ImM原兒茶酸以及23mM D-葡萄糖?；九囵B(yǎng)基中48小時(shí)后，AB2834/pKD136/pKD8. 243A/pKD8. 292用17mM順順-粘康酸鹽替代了 56mM D-葡萄糖。[0108]實(shí)施例7A圖7A顯示20L批次培養(yǎng)WNl/pWN2. 248生產(chǎn)順?lè)?粘康酸的結(jié)果。培養(yǎng)物在OD600=33時(shí)每6小時(shí)用IPTG誘導(dǎo)(IOOmM, 10mL)o約88小時(shí)后，粘康酸滴度為59g/L (30%產(chǎn)量)且合成的粘康酸總量為1475g。這對(duì)應(yīng)于約88小時(shí)中約I. 38M葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?. 42M順?lè)?粘康酸。表I顯示整個(gè)培養(yǎng)期間各時(shí)間的順?lè)?粘康酸產(chǎn)率。(應(yīng)注意該表顯示誘導(dǎo)后產(chǎn)率隨著時(shí)間的變化。若排除異常數(shù)據(jù)點(diǎn)(接種后48小時(shí)和接種后58小時(shí))，平均速率為I. lg/L/h。)還發(fā)現(xiàn)IPTG重結(jié)晶(如在乙酸乙酯中)能增加粘康酸滴度。例如，數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示20L規(guī)模下約55-60g/L的粘康酸滴度，其比沒(méi)有IPTG重結(jié)晶時(shí)觀察到的約50g/L產(chǎn)量提高約17% (如約30%對(duì)比24%的產(chǎn)量)
表I發(fā)酵中順順-粘康酸鹽產(chǎn)率
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生順?lè)?粘康酸鹽的方法，所述方法包括 提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽； 在基本所有順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽的反應(yīng)條件下將順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽； 分離所述順?lè)?粘康酸鹽；和 結(jié)晶所述順?lè)?粘康酸鹽。
2.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括 在含所述可再生碳源的培養(yǎng)基中和在所述可再生碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸且所述3-脫氫莽草酸被生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸鹽的條件下培養(yǎng)表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的重組細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)用酸催化，其中所述酸可為無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸。
4.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)在pH為約3.O-約6. 5或約.3.5-約4. 5的溶液中進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)在47°C或更高的溫度下或在約60° C或更高的溫度下進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)基本在8、7.75,7. 5,7. 25、7、6_ 75、6. 5、6. 25、6、5. 75、5. 5、5. 25、5、4. 75、4. 5、4. 25、4、3. 75、3. 5、3. 25、3、2. 75、2. 5、.2.25.2.1. 75.1. 5.1. 25.U0. 75.0. 5 或 0. 25 小時(shí)內(nèi)完成。
7.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)在基本沒(méi)有順?lè)?粘康酸鹽沉淀的情況下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)步驟產(chǎn)生含有所述重組細(xì)胞和胞外順?lè)?粘康酸鹽的肉湯，且還包括從所述肉湯中移除所述重組細(xì)胞的步驟。
9.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述分離步驟包括通過(guò)酸化從溶液中沉淀所述順?lè)?粘康酸鹽，其中所述溶液優(yōu)選酸化成PH低于約3. 0或低于約2. O。
10.如權(quán)利要求
9所述的方法，其特征在于，所述分離步驟還包括將所述溶液冷卻到低于約37° C、低于約25° C、低于約-4° C或低于約-20° C的溫度。
11.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括監(jiān)控順順-粘康酸鹽向順?lè)?粘康酸鹽的異構(gòu)化。
12.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述順?lè)?粘康酸鹽用有機(jī)溶劑結(jié)晶，其中所述有機(jī)溶劑優(yōu)選包含甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氫呋喃中的一種或多種。
13.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括從分離的順?lè)?粘康酸鹽中移除鹽，其中所述鹽優(yōu)選包含無(wú)機(jī)鹽。
14.如權(quán)利要求
9所述的方法，其特征在于，所述方法還包括 沉淀第一批順?lè)?粘康酸鹽后濃縮所述溶液；和 從所述濃縮溶液中沉淀第二批順?lè)?粘康酸鹽。
15.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)在高于約大氣壓的壓力下進(jìn)行。
16.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將至少約65%的順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽、將至少約75%的順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽、將至少約85%的順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽或?qū)⒅辽偌s95%的順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽。
17.如權(quán)利要求
16所述的方法，其特征在于，所述順?lè)?粘康酸鹽在I2、貴金屬加氫催化劑、海綿金屬加氫催化劑或骨架加氫催化劑催化的反應(yīng)中異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽。
18.—種產(chǎn)生順?lè)?粘康酸鹽的方法，所述方法包括 提供含從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽的發(fā)酵肉湯； 在基本所有順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽的反應(yīng)條件下將順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽； 從所述肉湯中分離順?lè)?粘康酸鹽；和 結(jié)晶所述順?lè)?粘康酸鹽。
19.如權(quán)利要求
18所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵肉湯包含表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的重組細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求
19所述的方法，其特征在于，所述方法還包括從所述發(fā)酵肉湯中移除所述重組細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求
18所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵肉湯在容器中提供，且其中所述異構(gòu)化反應(yīng)在所述容器中進(jìn)行，其中所述容器優(yōu)選發(fā)酵罐容器。
22.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，所述方法還包括 在含所述可再生碳源的培養(yǎng)基中和在所述可再生碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸且所述3-脫氫莽草酸被生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸鹽的條件下培養(yǎng)表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的重組細(xì)胞，和 其中所述重組細(xì)胞在所述發(fā)酵罐容器中培養(yǎng)，從而產(chǎn)生所述發(fā)酵肉湯。
23.如權(quán)利要求
I或18所述的方法，其特征在于，所述分離步驟包括用有機(jī)溶劑從溶液中提取順?lè)?粘康酸鹽。
24.如權(quán)利要求
23所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑包含甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氫呋喃中的一種或多種。
25.如權(quán)利要求
23所述的方法，其特征在于，所述分離步驟在低于約7、6.75,6. 5、6.25,6,5. 75,5. 5,5. 25,5,4. 75,4. 5,4. 25,4,3. 75,3. 5,3. 25、或 3 的 pH 下進(jìn)行。
26.如權(quán)利要求
23所述的方法，其特征在于，所述分離步驟還包括從無(wú)機(jī)鹽中分離所述順?lè)?粘康酸鹽。
27.如權(quán)利要求
23所述的方法，其特征在于，所述分離步驟相對(duì)于不包括用有機(jī)溶劑從溶液中提取順?lè)?粘康酸鹽的方法提高順?lè)?粘康酸鹽的分離產(chǎn)量。
28.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述提供含從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽使用轉(zhuǎn)化有來(lái)自肺炎桿菌的表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶以及來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的表達(dá)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的異源結(jié)構(gòu)基因的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物在約88小時(shí)內(nèi)將至少約I. 38M葡萄糖生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)橹辽偌s0. 42M順順-粘康酸。
29.如權(quán)利要求
28所述的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體還包括表達(dá)3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸鹽合成酶和3-脫氫奎尼酸合成酶的異源DNA序列。
30.如權(quán)利要求
29所述的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體還包括表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶的異源DNA序列。
31.如權(quán)利要求
30所述的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述細(xì)菌細(xì)胞選自具有芳族氨基酸生物合成共同途徑中具有阻斷3-脫氫 莽草酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉种岬耐蛔兊耐蛔兗?xì)胞系。
32.如權(quán)利要求
28所述的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述細(xì)菌細(xì)胞選自具有芳族氨基酸生物合成共同途徑中具有阻斷3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉种岬耐蛔兊耐蛔兗?xì)胞系。
33.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征自在于，所述提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽包括在含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有來(lái)自肺炎桿菌的表達(dá)酶種類3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶的結(jié)構(gòu)基因以及來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的表達(dá)酶種類鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的結(jié)構(gòu)基因的細(xì)菌細(xì)胞，通過(guò)3-脫氫莽草酸的生物催化轉(zhuǎn)變以至少約0. 95毫摩爾/升/小時(shí)的速率生產(chǎn)順順-粘康酸，所述碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸。
34.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征自在于，所述提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽包括在含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞，通過(guò)3-脫氫莽草酸的生物催化轉(zhuǎn)變以至少約0. 95毫摩爾/升/小時(shí)的速率生產(chǎn)順順-粘康酸，所述細(xì)胞表達(dá)編碼3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶、鄰苯二酚1，2-雙加氧酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸鹽合成酶和3-脫氫奎尼酸合成酶的異源結(jié)構(gòu)基因，所述碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸。
35.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征自在于，所述提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽包括在含碳源的培養(yǎng)基中，在所述碳源以至少約0. 95毫摩爾/升/小時(shí)的速率生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有來(lái)自肺炎桿菌的表達(dá)酶種類3-脫氫莽草酸脫水酶和原兒茶酸鹽脫羧酶的結(jié)構(gòu)基因以及來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的表達(dá)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的結(jié)構(gòu)基因的細(xì)菌細(xì)胞。
36.一種由權(quán)利要求
1-15和18-35中任一項(xiàng)所述方法生產(chǎn)的可再生順?lè)?粘康酸鹽。
37.一種產(chǎn)生反反-粘康酸鹽的方法，所述方法包括 將從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)化生成的順順-粘康酸鹽在基本所有順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽的反應(yīng)條件下異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽。
38.如權(quán)利要求
37所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)由貴金屬加氫催化劑、海綿金屬加氫催化劑或骨架加氫催化劑催化。
39.一種產(chǎn)生反反-粘康酸鹽的方法，所述方法包括 將從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)化生成的順?lè)?粘康酸鹽在基本所有順?lè)?粘康酸鹽異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽的反應(yīng)條件下異構(gòu)化為反反-粘康酸鹽。
40.如權(quán)利要求
39所述的方法，其特征在于，所述異構(gòu)化反應(yīng)由貴金屬加氫催化劑、海綿金屬加氫催化劑或骨架加氫催化劑催化。
41.一種由權(quán)利要求
16-17和37-40中任一項(xiàng)所述方法生產(chǎn)的可再生反反-粘康酸鹽。
專利摘要
一種生產(chǎn)粘康酸鹽的順?lè)?和反反-異構(gòu)體的方法，所述方法通過(guò)提供從可再生碳源經(jīng)生物催化轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的順順-粘康酸鹽；在基本所有順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽的反應(yīng)條件下將順順-粘康酸鹽異構(gòu)化為順?lè)?粘康酸鹽；分離順?lè)?粘康酸鹽；和結(jié)晶所述順?lè)?粘康酸鹽。順?lè)?異構(gòu)體還可異構(gòu)化為反反-異構(gòu)體。在一個(gè)示例中，所述方法包括在含所述可再生碳源的培養(yǎng)基中和在所述可再生碳源被細(xì)胞的芳族氨基酸生物合成共同途徑中的酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫莽草酸且所述3-脫氫莽草酸被生物催化轉(zhuǎn)變?yōu)轫橅?粘康酸鹽的條件下培養(yǎng)表達(dá)3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸鹽脫羧酶和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的重組細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N9/02GKCN102985537SQ201180012960
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2011年1月10日
發(fā)明者V·布伊, 劉民杰, D·麥克雷, D·施韋策 申請(qǐng)人:阿邁瑞斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan