專利名稱:具有增強的3’-錯配辨別力的dna聚合酶的制作方法
具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶
發(fā)明領域
本發(fā)明提供了具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶及它們在各種應用，包括核酸多核苷酸延伸和擴增中的用途。
發(fā)明背景
DNA聚合酶負責基因組的復制和維護，這是在世代間(from generation togeneration)精確傳遞遺傳信息的中心職責。DNA聚合酶在細胞中的功能是作為負責DNA合成的酶。它們在有金屬活化劑如Mg2+存在的情況下，以被復制的DNA模板或多核苷酸模板支配的順序聚合脫氧核糖核苷三磷酸。在體內(nèi)，DNA聚合酶參與一系列DNA合成過程，包括DNA復制、DNA修復、重組和基因擴增。在每一 DNA合成過程期間，復制DNA模板一次或最多幾次以產(chǎn)生相同的復制品。與此相反，在體外，DNA復制可以重復多次，例如在聚合酶 鏈式反應期間(參見例如美國專利號4，683，202)。
在聚合酶鏈式反應(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一輪DNA復制的開始時添加的(參見上述美國專利號4，683，202)。后來，確認了從在高溫下生長的細菌中可獲得熱穩(wěn)定DNA聚合酶，這些酶只需要添加一次(參見美國專利號4，889，818和美國專利號4，965，188)。在PCR期間使用的高溫下，這些酶沒有不可逆地失活。因此，可以進行聚合酶鏈式反應的重復循環(huán)而不需要在每一合成加成過程開始時添加新鮮的酶。DNA聚合酶特別是熱穩(wěn)定聚合酶，是重組DNA研究和疾病的醫(yī)療診斷中大量技術的關鍵。特別是對于診斷應用，目標核酸序列可能僅僅是所考察(in question) DNA或RNA的一小部分，因此在不擴增的情況下可能難以檢測到目標核酸序列的存在。
DNA聚合酶的總體折疊模式類似人的右手，包含手掌、手指和拇指三個獨特的亞結(jié)構域。(參見 beese 等，Science 260:352-355, 1993) ;Patel 等，Biochemistry34:5351-5363, 1995)。盡管在大小和細胞功能不同的聚合酶之間手指和拇指亞結(jié)構域的結(jié)構變化很大，但是催化性的手掌亞結(jié)構域全部都是重疊的(superimposable)。例如，在化學催化作用期間與引入的dNTP相互作用并穩(wěn)定過渡態(tài)的基序A在哺乳動物pol a和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之間是重疊的，平均偏差約為IA (Wang等，Cell 89:1087-1099，1997)。在結(jié)構上基序A以主要包含疏水性殘基的反向平行￠-折疊鏈起始，延續(xù)到a-螺旋。DNA聚合酶活性位點的主要氨基酸序列是特別保守的。在基序A的情況下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:28)保留在從數(shù)百萬年進化分離的生物體包括例如水生棲熱菌 iThormus aquaticus)、沙眼衣原體{Chlamydia trachomatis)和大腸桿菌 ipscherichiaCOIi)的聚合酶中。
除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位點也被證明是相對易變的，能夠容納某些氨基酸取代而不顯著降低DNA聚合酶活性。(參見例如美國專利號6，602，695)。這種突變型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反應的診斷和研究應用中提供各種選擇優(yōu)勢。因此，本領域需要鑒別適于突變的氨基酸位置以產(chǎn)生改進的聚合酶活性。本發(fā)明，如同本文中所述，滿足這些及其它需要。
發(fā)明概述本文提供了相對于對應的未修飾的對照聚合酶具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶以及制備和使用這種DNA聚合酶的方法。在一些實施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在一些實施方案中，DNA聚合酶是熱活性的DNA聚合酶。在一些實施方案中，DNA聚合酶源自棲熱菌種species)。在一些實施方案中，DNA聚合酶源自棲熱袍菌種{Thermotoga species)。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的572位的DNA聚合酶的氨基酸是除A，Q或S以外的任何氨基酸，除了對應于SEQ ID NO:1的572位的對照DNA聚合酶的氨基酸是A，Q或S，對照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的572位的位置處的氨基酸選自G，V，L, I,M, F，W, P，T, C，Y，N，D, E, K，R或H。在一些實施方案中，對應于SEQ ID N0:1的572位的位置處的氨基酸是具有極性、帶負電荷的側(cè)鏈的氨基酸(即，D或E)。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的572位的位置處的氨基酸是D。在一些實施方案中，具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結(jié)構域中包含基序，所述基序包含
Q-X1-Xa-Xg-XfT-G-R-L-S-S，其中
X1是T或A ;
X2是八，G或L;
X3是T或V ;和
X4是除A，S或Q以外的任何氨基酸(SEQ ID N0:8)。
在一些實施方案中，X4選自 G，L, M, W, P，T, F，Y，C，N，D, E, V, I, R,K 或H (SEQ ID NO:42).。
在一些實施方案中，具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結(jié)構域中包含基序，所述基序包含
Q-T-X2-T-X4-T-G-R-L-S-S,其中
X2是A或G ;和
X4是除A以外的任何氨基酸(SEQ ID N0:9)。
在一些實施方案中，具有增強的3’-錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結(jié)構域中包含基序，所述基序包含
Q-T-A-T-X4-T-G-R-L-S-S,其中
X4是除A以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 10)。
在一些實施方案中，X3是具有極性，帶負電荷的側(cè)鏈的氨基酸(即，D或E)。
在一些實施方案中，X4是D (SEQ ID NO: 11)。
在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸選自L，G, T, Q, A, S，N，R和K。在一些實施方案中，對應于SEQID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是G。
各種DNA聚合酶適于本發(fā)明的突變。尤其適合的是熱穩(wěn)定聚合酶，包括來自各種嗜熱菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的熱穩(wěn)定聚合酶，以及通過氨基酸取代、插入或缺失或其它修飾而源自這種野生型或天然存在的酶的合成的熱穩(wěn)定聚合酶。示例性的聚合酶的未修飾形式包括例如CS5 (SEQ ID NO:29)或CS6 (SEQ ID NO: 30)或Z05 DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)，或與其具有至少80%、優(yōu)選至少90%或更優(yōu)選至少95%的序列同一性的功能性DNA聚合酶。其它未修飾的聚合酶包括例如來自于下列嗜熱菌中任一種的DNA聚合酶(或與這種聚合酶具有至少80%、優(yōu)選至少90%或更優(yōu)選至少95%的序列同一性的功能性DNA聚合酶)海棲熱袍菌{Thermotoga maritima) (SEQ ID NO: 38)；水生棲熱菌 kThermus aquaticus) (SEQ ID NO:2);嗜熱棲熱菌(Jhermus thermophilus)(SEQ ID NO:6);黃棲熱菌(Jlwrmus flavus) (SEQ ID NO:4);絲狀棲熱菌 iThormusfiliformis) (SEQ ID NO: 3);棲熱菌種 Spsl7 (Se/WM/s sp. spsl7) (SEQ ID NO: 5);棲熱菌種 ZO5 (Se/WM/s sp. Z05) (SEQ ID NO:1);那不勒斯棲熱袍菌(Jhermotoga neopolitana)(SEQ ID NO:39);非洲棲熱腔菌{Thermosipho africanus) (SEQ ID NO:37) ；Thermuscaldophilus (SEQ ID NO:7),耐放射異常球菌{Deinococcus radiodurans) (SEQ IDNO: 36)，嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus s tearo thermophi I us) (SEQ ID NO: 40)或熱堅芽孢桿菌{Bacillus caldotenax) (SEQ ID NO:41)。合適的聚合酶還包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性和/或能夠摻入非常規(guī)核苷酸如核糖核苷酸或其它2’ -修飾的核苷酸的那些。
盡管具有有效的3’ -錯配辨別力活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶尤其適合用于進行PCR,具有有效的3’ -錯配辨別力活性的熱活性的、但不是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶也適于本發(fā)明的突變。
在一些實施方案中，DNA聚合酶是棲熱菌屬DNA聚合酶。例如，在一些實施方案中，DNA聚合酶與選自下列的聚合酶具有至少80%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%的序列同一性
(a)棲熱菌種ZOOTNA 聚合酶(ZO5) (SEQ ID NO:1);
(b)水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq)(SEQ ID NO: 2);
(c)絲狀棲熱菌DNA聚合酶(Tfi)(SEQ ID NO: 3);
(d)黃棲熱菌DNA 聚合酶(Tfl) (SEQ ID NO:4);
(e)棲熱菌種Spsl7DNA 聚合酶(Spsl7) (SEQ ID NO: 5);
(f)嗜熱棲熱菌DNA聚合酶(Tth)(SEQ ID NO:6);和
(g)Thermus caldophilus DNA 聚合酶(Tea) (SEQ ID NO: 7)。
在一些實施方案中，DNA聚合酶是棲熱袍菌DNA聚合酶。例如，在一些實施方案中，DNA聚合酶與選自下列的聚合酶具有至少80%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%的序列同一性
(a)海棲熱袍菌DNA聚合酶(Tma)(SEQ ID NO: 38);
(b)那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶(Tne)(SEQ ID NO: 39);
在某些實施方案中，DNA聚合酶與SEQ ID N0:1具有至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%的序列同一性。在一些實施方案中，DNA聚合酶是棲熱菌種Z05 DNA聚合酶(Z05)DNA聚合酶(即SEQ ID NO: 1)，除了 572位的氨基酸是除A以外的任何氨基酸。例如，在一些實施方案中，572位的氨基酸選自G，V, L, I, M, F，W, P，T, C，Y，N，D, E, K，R,H，Q,或S。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，572位的氨基酸是除A，Q或S以外的任何氨基酸。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，572位的氨基酸是D。在一些實施方案中，DNA聚合酶是進一步包含580位的取代的Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸選自L，G, T, Q, A, S，N，R和K。在一些實施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，580位的氨基酸是G。
突變的或改進的聚合酶可以包括其它非取代的修飾。一種這種修飾是熱可逆的共價修飾，其使酶失活，但是在高溫，如通常用于多核苷酸延伸的溫度下孵育后其被逆轉(zhuǎn)而激活酶。Birch等的美國專利號5，773，258和5，677，152中描述了這種熱可逆的修飾的示例性試劑。
在一些實施方案中，通過在具有預定拷貝數(shù)的野生型BRAF V600R目標多核苷酸和預定拷貝數(shù)的突變型BRAF V600目標多核苷酸(數(shù)量上等于或少于野生型目標的拷貝數(shù)(例如，10，000或更少拷貝))的一個或多個反應混合物中在正向引物(與突變型序列 完美匹配并且與野生型序列具有一個單一的3’A:C錯配)存在的情況下使用具有SEQ IDN0:35(野生型BRAF = SEQ ID NO:34)的核酸序列的突變型BRAF V600R目標多核苷酸而測定3’-錯配活性。兩個或更多的反應混合物可以具有滴定的拷貝數(shù)的突變型BRAF V600R目標多核苷酸(例如，在數(shù)個反應混合物中，1:5滴定，1:10滴定，例如，10，000拷貝，1000拷貝，100拷貝，10拷貝，I拷貝，0拷貝)。如本文中所述，可以在預先選擇的單位時間，將本發(fā)明的聚合酶的3’ -錯配辨別力與參照聚合酶(例如，天然存在的或未修飾的聚合酶)的3’-錯配辨別力相比較。當與突變型等位基因完美匹配的引物接觸時，具有增強的3’ -錯配辨別力的聚合酶將不能擴增野生型序列，或者，與天然存在的或未修飾的聚合酶相t匕，使用突變型等位基因特異性引物擴增野生型序列將需要更大的PCR循環(huán)數(shù)(即，表現(xiàn)出更高的Cp值)。
在各種其它方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述的突變的或改進的DNA聚合酶的重組核酸，包含該重組核酸的載體，和/或用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在某些實施方案中，所述載體是表達載體。包含這種表達載體的宿主細胞可用于本發(fā)明的生產(chǎn)突變的或改進的聚合酶的方法，所述方法通過在適于表達重組核酸的條件下培養(yǎng)宿主細胞。反應混合物和/或試劑盒中可以包含本發(fā)明的聚合酶。重組核酸，宿主細胞，載體，表達載體，反應混合物和試劑盒的實施方案如上面和本文中所述。
在另一方面，提供了實施多核苷酸延伸的方法。該方法總體包括在適于引物延伸的條件下將本文所述的具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶與引物、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接觸，從而產(chǎn)生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。三磷酸核苷可以包括非常規(guī)核苷酸如核糖核苷酸和/或標記的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一個或更多個核苷酸類似物。在一些變型中，多核苷酸延伸方法是用于多核苷酸擴增的方法，包括在適于多核苷酸擴增的條件下將突變的或改進的DNA聚合酶與引物對、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接觸。多核苷酸延伸反應可以是，例如，PCR，等溫延伸，或測序(例如，454測序反應)。
在一些實施方案中，引物延伸方法是用于實施聚合酶鏈式反應(PCR)的方法。
本發(fā)明還提供了用于這種多核苷酸延伸方法中的試劑盒。通常，試劑盒包括至少一個提供本文所述的突變的或改進的DNA聚合酶的容器。在某些實施方案中，試劑盒進一步包括提供一種或更多種額外試劑的一個或更多個額外的容器。例如，在特定的變型中，一個或更多個額外的容器提供三磷酸核苷；適于多核苷酸延伸的緩沖劑；和/或在多核苷酸延伸條件下與預定的多核苷酸模板雜交的引物。[0024]進一步提供了包含本發(fā)明的聚合酶的反應混合物。反應混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一種或多種引物或探針多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，標記的核苷酸，非常規(guī)的核苷酸)，緩沖劑，鹽，標記(例如，突光團)。
本文描述了本發(fā)明的進一步的實施方案。
定義
除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬技術領域：
的普通技術人員通常理解的相同的意義。盡管基本上與本文所述的那些相似的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實踐或試驗，但是僅僅描述了示例性的方法和材料。對于本發(fā)明的目的，下列術語定義如下。[0027]術語“一(a)，” “一(an)，”和“該(the) ”包括復數(shù)對象，除非上下文清楚地指出別的含義。
“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何單體單位。如本文所用，術語“氨基酸”包括下列20種天然或遺傳編碼的a-氨基酸丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。在其中“X”殘基沒有定義的情況下，這些應該定義為“任何氨基酸”。這20種天然氨基酸的結(jié)構見例如Stryer 等，BioChemistry, 5th ed. , Freeman and Company (2002)。額外的氨基酸如硒代半胱氨酸和批咯賴氨酸也能夠被遺傳編碼(Stadtman (1996) “Selenocysteine, ” AnnuRev Biochem. 65:83-100 和 Ibba 等.(2002) “Genetic code:1ntroducing pyrrolysine, ”Curr Biol. 12(13) :R464-R466)。術語“氨基酸”還包括非天然氨基酸、修飾的氨基酸(例如， 具有修飾的側(cè)鏈和/或骨架)和氨基酸類似物。參見，例如，Zhang等.(2004) “Selectiveincorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells, ” Proc.Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 101 (24) :8882-8887, Anderson 等 (2004) “An expandedgenetic code with a functional quadruplet codon，，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A.101 (20) : 7566-7571, Ikeda 等.(2003) “Synthesis of a novel histidine analogueand its efficient incorporation into a protein in vivo, ” Protein EnR. Des. Sel.16 (9) : 699-706, Chin 等.(2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science301(5635):964-967, James等.(2001) “Kinetic characterization of ribonuclease Smutants containing photoisomerizabIe phenylazophenylalanine residues, ” ProteinEnR. Des. Sel. 14(12) :983-991, Kohrer 等.(2001) “Import of amber and ochresuppressor tRNAs into mammalian cells:A general approach to site-specificinsertion of amino acid analogues into proteins, ” Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A.98(25):14310-14315, Bacher 等 (2001) “Selection and Characterization ofEscherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic TryptophanAnalogue,，，.1. Bacteriol. 183(18) :5414-5425, Hamano-Takaku 等 (2000) “AMutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the UnnaturalAmino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, ” J. Biol. Chem.275 (51) :40324_40328，和Budisa等.(2001) “Proteins with {beta} -(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids, ”Protein Sc1. 10 (7):1281-1292。
為了進一步說明，氨基酸典型地為包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一種或多種側(cè)鏈或基團，或這些基團的任一種的類似物的有機酸。示例性的側(cè)鏈包括，例如疏基、砸基、橫酸基、燒基、芳基、酸基、麗基、置氣基、輕基、餅、氛基、齒素、酸餅、鏈烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸鹽(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺或這些基團的任何組合。其它代表性的氨基酸包括但不限于，包含光敏交聯(lián)劑的氨基酸、金屬結(jié)合氨基酸、自旋標記的氨基酸、發(fā)熒光的氨基酸、包含金屬的氨基酸、含新官能團的氨基酸、與其它分子共價或非共價相互作用的氨基酸、對光不穩(wěn)(photocaged)和/或可光異構化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修飾的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化學可裂的和/或光可裂的氨基酸、包含碳連接糖的氨基酸、氧化還 原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一個或多個毒性部分的氨基酸。
術語“適配子”是指識別并結(jié)合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的單鏈DNA，如美國專利號5，693，502中所述。
在本發(fā)明的DNA聚合酶上下文中的術語“突變體”是指相對于對應的天然存在的或未修飾的DNA聚合酶包含一個或多個氨基酸取代的多肽，典型為重組的。
在突變型聚合酶上下文中的術語“未修飾的形式”在本文中是用來定義本發(fā)明的突變型DNA聚合酶的術語術語“未修飾的形式”是指具有除指定為表征突變型聚合酶的一個或多個氨基酸位置以外的突變型聚合酶的氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，在(a)其未修飾的形式和(b) —個或多個特定氨基酸取代的方面提到突變型DNA聚合酶是指除特定的氨基酸取代以外，突變型聚合酶在特定的基序中另外具有與未修飾的形式相同的氨基酸序列?！拔葱揎椀木酆厦浮?和因此還有具有增強的3’-錯配辨別力的修飾的形式)可以包含額外的突變以提供期望的功能性，例如雙脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸類似物、染料標記的核苷酸的改進的摻入，調(diào)節(jié)5’ -核酸酶活性，調(diào)節(jié)3’ -核酸酶(或校正)活性等。因此，在實施本文所述的本發(fā)明時，DNA聚合酶的未修飾的形式是預先確定的。DNA聚合酶的未修飾的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已經(jīng)有意識地修飾過的DNA聚合酶。聚合酶的未修飾的形式優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶,如來自各種嗜熱菌的DNA聚合酶以及與野生型或天然存在的熱穩(wěn)定聚合酶具有基本上序列同一性的其功能性變體。這種變體可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶，如美國專利號6，228，628和美國申請公開號2004/0005599中所述的嵌合DNA聚合酶。在某些實施方案中，聚合酶的未修飾的形式具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。
術語“熱穩(wěn)定聚合酶”是指對熱穩(wěn)定的酶，其是耐熱的，當經(jīng)受高溫并持續(xù)影響雙鏈核酸變性所必需的時間時，其保留足夠的活性以影響隨后的多核苷酸延伸反應，并且沒有變得不可逆變性的(失活的)。核酸變性所需的加熱條件是本領域公知的，在例如美國專利號4，683，202,4, 683，195和4，965，188中舉例說明。如本文所述，熱穩(wěn)定聚合酶適于在溫度循環(huán)變化的反應如聚合酶鏈式反應(“PCR”)中使用。用于本文目的的不可逆變性指酶活性的永久且完全的損失。對于熱穩(wěn)定聚合酶，酶活性是指以適當?shù)姆绞酱呋塑账岬慕M合以形成與模板核酸鏈互補的多核苷酸延伸產(chǎn)物。來自嗜熱菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶包括，例如來自海棲熱袍菌，水生棲熱菌，嗜熱棲熱菌，黃棲熱菌，絲狀棲熱菌，棲熱菌種Spsl7，棲熱菌種Z05, Thermus cWoMHys,熱堅芽孢桿菌,那不勒斯棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌的DNA聚合酶。
術語“熱活性的”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反應中逆轉(zhuǎn)錄或退火/延伸步驟的溫度(即，45-80°C )保持催化性能的酶。熱穩(wěn)定酶是當經(jīng)受對于核酸變性所必需的高溫時不會被不可逆地失活或變性的那些酶。熱活性的酶可以是或可以不是熱穩(wěn)定的。熱活性的DNA聚合酶可以是DNA或RNA依賴于嗜熱種或依賴于嗜常溫種，包括但不限于，大腸桿菌，莫洛尼小鼠白血病病毒和禽成髓細胞瘤病毒(Avian myoblastosis virus) 0·
如本文使用的，“嵌合”蛋白是指氨基酸序列代表來自至少兩種不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合產(chǎn)物的蛋白。嵌合蛋白典型地不是通過氨基酸序列的直接操作產(chǎn)生，而是從編碼該嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表達的。在某些實施方案中，例如，本發(fā)明的突變型DNA聚合酶的未修飾形式是由來源于棲熱菌種DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)區(qū)域和來源于Tma DNA聚合酶的羧基末端(C-末端)區(qū)域組成的嵌合蛋白。N-末端區(qū)域是指從N-末端(氨基酸位置I)延伸到內(nèi)部氨基酸的區(qū)域。類似地，C-末端區(qū)域是指從內(nèi)部氨基酸延伸到C-末端的區(qū)域。
在DNA聚合酶的上下文中，與另一條序列(例如區(qū)域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“對應”是基于根據(jù)核苷酸或氨基酸位置數(shù)編號并且然后以最大化序列同一性百分比的方式比對序列的規(guī)則。因為不是給定的“對應區(qū)域”內(nèi)的所有位置都需要是相同的，對應區(qū)域內(nèi)的非匹配位置可以被認為是“對應位置”。因此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的“對應于氨基酸位點[X]的氨基酸位置”是指，基于比對，在其它DNA聚合酶和結(jié)構同源物和家族中的等效位置。在本發(fā)明的一些實施方案中，氨基酸位置的“對應”是根據(jù)包含SEQ IDNO:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39，40或41的一個或多個基序的聚合酶區(qū)域來確定的。當聚合酶多肽序列不同于SEQ ID NOS:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39，40或41 (例如，通過氨基酸的變化或氨基酸的增加或缺失)時，可能與本文所討論的改進的活性相關的特定突變將不是在與它在SEQ ID NOS:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39，40或41中相同的位置數(shù)。例如，在表I中說明了這一點。
如本文使用的，“重組體”是指已經(jīng)通過重組方法有意識地修飾過的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的術語“重組核酸”是指通常通過內(nèi)切核酸酶的核酸操作，最初在體外形成的以自然中通常不存在的形式的核酸。因此，線性形式的分離的突變型DNA聚合酶核酸或通過連接通常不結(jié)合的DNA分子體外形成的表達載體都被認為是用于本發(fā)明的目的的重組體?？梢岳斫獾氖牵坏┲亟M核酸被制備并重新引入宿主細胞，它將非重組地復制，即，使用宿主細胞的體內(nèi)細胞機制而不是體外操作；然而，這種核酸一旦重組產(chǎn)生，盡管隨后非重組復制，仍然被認為是用于本發(fā)明的目的的重組體?！爸亟M蛋白”是使用重組技術，即通過上述重組核酸的表達制備的蛋白。
當被置于與另一種核酸序列的功能性關系時核酸是“可操作連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是與編碼序列可操作連接的；或者如果核糖體結(jié)合位點被定位以促進翻譯，那么它是與編碼序列可操作連接的。
術語“宿主細胞”是指單細胞的原核生物和真核生物有機體(例如細菌、酵母和放線菌)以及細胞培養(yǎng)物中生長的來自高等植物或者動物的單個細胞。
術語“載體”指一條DNA，典型是雙鏈的，它可以是其中已經(jīng)插入了一條外源DNA的。載體可以是例如質(zhì)粒來源的。載體包含在宿主細胞中促進載體的自主復制的“復制子”多核苷酸序列。外源DNA定義為異源的DNA，其是在宿主細胞中天然不存在的DNA，例如，其復制載體分子，編碼可選擇或可篩選的標記，或者編碼轉(zhuǎn)基因。載體用于轉(zhuǎn)運外源的或異源的DNA進入合適的宿主細胞。一旦在宿主細胞中，載體可以獨立于宿主染色體DNA復制或與宿主染色體DNA同時復制，可以產(chǎn)生數(shù)個拷貝的載體及其插入的DNA。另外，載體還可以包含容許插入的DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA分子或者使插入的DNA復制為多拷貝的RNA的必要元件。一些表達載體還包括插入的DNA附近的序列元件，其增加表達的mRNA的半衰期，和/或允許所述mRNA翻譯為蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的DNA編碼的mRNA和多肽的許多分子。
術語“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體以外，本文中還應當理解為是指其相關的結(jié)構變體，包括衍生物和類似物，其對于使用該核苷酸的特定上下文(例如，與互補堿基雜交)在功能上是等效的，除非上下文明確另外指明。
術語“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物，其可以對應于核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)聚合物或其類似物。這包括核苷酸的聚合物如RNA和DNA，以及其合成形式、修飾(例如化學或生物化學修飾的)形式，和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亞單位)。示例性的修飾包括甲基化，用類似物取代一個或更多個天然存在的核苷酸，核苷酸間的修飾如不帶電的鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸鹽等)，側(cè)面部分(例如多肽)，嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)，螯合劑，烷化劑，和修飾的鍵(例如a異頭核酸等)。還包括模擬多核苷酸通過氫鍵及其他化學相互作用與指定序列結(jié)合的能力的合成分子。雖然合成形式的核酸可以包括其它鍵(例如，Nielsen等(Science 254:1497術語“寡核苷酸”是指包括至少2個核酸單體單位(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸典型地包括約6-約175個核酸單體單位，更典型地約8-約100個核酸單體單位，仍更典型地約10-約50個核酸單體單位(例如約15，約20，約25，約30，約35，或更多的核酸單體單位)。寡核苷酸的確切大小取決于許多因素，包括該寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸任選地通過任何合適的方法制備，包括但不限于現(xiàn)有或天然序列的分離，DNA復制或擴增，逆轉(zhuǎn)錄，適當序列的克隆和限制性消化，或通過例如，Narang等的磷酸三酯法(Meth.Enzymol. 68:90-99，1979) ；Brown 等的憐酸二酯法 Qkth. Enzymol. 68:109-151,1979) ;Beaucage 等的二乙基亞憐酸胺法{Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)；Matteucci 等的三酯法(7； Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981);自動合成法；或美國專利號4，458，066的固相支持法，或本領域技術人員已知的其它方法的方法直接化學合成。[0044]本文中使用的術語“引物”是指當置于起始多核苷酸延伸的條件下(例如，在包括在適當?shù)木彌_液中存在所需的三磷酸核苷(在要拷貝的模板支配下)和聚合酶以及在合適的溫度或溫度的循環(huán)(例如在聚合酶鏈式反應中)的條件下)能夠作為模板引導的核酸合成的起始點的多核苷酸。為了進一步說明，引物還可以用于多種其它寡核苷酸介導的合成過程，包括作為RNA從頭合成和體外轉(zhuǎn)錄相關的過程(例如基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TM)等)的引發(fā)劑。引物典型是單鏈寡核苷酸(例如寡脫氧核糖核苷酸)。引物的適當長度取決于該引物預期的用途，但是典型地為6-40個核苷酸，更典型地為15-35個核苷酸。短的引物分子通常需要更低的溫度以與模板形成足夠穩(wěn)定的雜合復合物。引物不需要反映模板的精確序列，但是必須是足夠互補的以便與模板雜交來發(fā)生引物延伸。在某些實施方案中，術語“引物對”表示一組引物，其包括與擴增的核酸序列的5’末端的互補序列雜交的5’有義引物(有時稱為"正向")以及與擴增的序列的3’末端雜交的3’反義引物(有時稱為〃反向")(例如，如果目標序列作為RNA表達或者是RNA)。如果需要，可以通過摻入用光譜學的、光化學的、生物化學的、免疫化學的或化學的方法可檢測的標記來標記引物。例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(通常用于ELISA測定中)、生物素、或者存在抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白。
術語“5’ -核酸酶探針”是指包含至少一個發(fā)光標記部分并用于5’ -核酸酶反應中以影響目標核酸檢測的寡核苷酸。在一些實施方案中，例如，5’ -核酸酶探針僅包括單一的發(fā)光部分(例如，熒光染料等)。在某些實施方案中，5’-核酸酶探針包括自我互補的區(qū)域，使得該探針能夠在選擇的條件下形成發(fā)夾結(jié)構。為了進一步說明，在一些實施方案中，5’ -核酸酶探針包括至少兩個標記部分，在兩個標記之一被裂解或者從寡核苷酸分離后發(fā)射增加強度的輻射。在某些實施方案中，用兩種不同的熒光染料，例如，5’末端報告染料和3’末端淬滅染料或部分標記5’-核酸酶探針。在一些實施方案中，在不同于或除了末端位置以外的一個或多個位置標記5’ -核酸酶探針。當探針完整時，通常在兩個熒光團之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使得從報告染料的熒光發(fā)射至少部分淬滅。在聚合酶鏈式反應的延伸步驟期間，例如，通過，例如，Taq聚合酶或具有這種活性的另一種聚合酶的5’至3’核酸酶活性裂解結(jié)合至模板核酸的5’ -核酸酶探針，使得報告染料的熒光發(fā)射不再被淬滅。示例性的5’ -核酸酶探針也描述在，例如，美國專利號5，210，015 ;美國專利號5，994，056 ;和美國專利號6，171，785中。在一些實施方案中，可以用兩種或更多種不同的報告染料和3’末端淬滅染料或部分標記5’核酸酶探針。
術語“FRET”或“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”或“Foerster共振能量轉(zhuǎn)移”是指至少兩個發(fā)色團、供體發(fā)色團和受體發(fā)色團(被稱為淬滅劑)之間的能量轉(zhuǎn)移。當供體被具有合適波長的光輻射激發(fā)時，供體通常將能量轉(zhuǎn)移至受體。受體通常以具有不同的波長的光輻射的形式重新發(fā)射轉(zhuǎn)移的能量。當受體是“黑暗”淬滅劑時，它耗散除光以外的形式的轉(zhuǎn)移的能量。特定的熒光團是否作為供體或受體起作用取決于FRET對其它成員的特性。常用的供體-受體對包括FAM-TAMRA對。常用的淬滅劑是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗淬滅劑包括BlackHole Quenchers (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc. , Novato, Cal. ), IowaBlack (Integrated DNA Tech., Inc. , Coralville, Iowa)和 BlackBerry Quencher650 (BBQ-650) (Berry & Assoc. , Dexter, Mich.)。
當涉及核酸堿基、三磷酸核苷或核苷酸時，術語“常規(guī)的”或“天然的”是指描述的多核苷酸中天然存在的那些(即，對于DNA，這些是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外，在體外DNA合成反應如測序中，經(jīng)常采用dITP和7-脫氮-dGTP來代替dGTP，經(jīng)常采用7-脫氮-dATP來代替dATP。共同地，這些稱為dNTPs。
當涉及核酸堿基、核苷或核苷酸時，術語“非常規(guī)的”或“修飾的”包括在特定的多核苷酸中天然存在的常規(guī)的堿基、核苷或核苷酸的修飾物、衍生物或類似物。與常規(guī)的dNTPs相比，某些非常規(guī)核苷酸在核糖的2’位置修飾。因此，盡管對于RNA，天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即ATP、GTP、CTP、UTP，共稱rNTPs)，因為這些核苷酸具有在糖的2’位的羥基，與之相比，dNTPs中沒有所述羥基，如本文使用的，作為DNA聚合酶的底物的核糖核苷酸可以是非常規(guī)的核苷酸。如本文使用的，非常規(guī)的核苷酸包括但不限于在核酸測序中用作終止劑的化合物。示例性的終止劑化合物包括但不限于具有2’，3’雙脫氧結(jié)構的稱為雙脫氧核苷三磷酸的那些化合物。雙脫氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP共同地稱為ddNTPs。終止劑化合物的其他例子包括核糖核苷酸的2’ -PO4類似物(參見，例如美國申請公開號2005/0037991和2005/0037398)。其它非常規(guī)的核苷酸包括硫代磷酸酯dNTPs ([ [ a ] -S] dNTPs)、5’ -[ a ]-硼烷(borano) -dNTPs、[ a ]-膦酸甲酯 dNTPs 和核糖核 苷三磷酸(rNTPs)?？梢杂梅派湫酝凰厝?2P、33P或35S ;熒光標記；化學發(fā)光標記；生物發(fā)光標記；半抗原標記如生物素；或者酶標記如鏈霉親和素或親和素來標記非常規(guī)的堿基。熒光標記可以包括帶負電荷的染料，如熒光素家族的染料，或者電荷中性的染料，如羅丹明家族的染料，或者帶正電荷的染料，如花菁家族的染料。熒光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN 和 Z0E。羅丹明家族的染料包括 Texas Red、ROX, R110、R6G 和 TAMRA。Perkin-Elmer(Boston, MA)、Applied Biosystems(Foster City, CA)或 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)銷售各種染料或用 FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE, ROX,Rl 10、R6G、Texas Red和TAMRA標記的核苷酸?；ㄝ技易宓娜玖习–y2、Cy3、Cy5和Cy7，由 GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire,England)銷售。
如本文使用的，通過在比較窗口比較兩個最佳比對的序列來確定“序列同一性百分比”，其中對于兩個序列的最佳比對，在比較窗口中的序列部分與參照序列(其不包括增加或缺失)相比可以包括增加或缺失(即缺口)。通過確定存在于兩個序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量以得到匹配位置的數(shù)量，用匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中的位置總數(shù)并用100乘以該結(jié)果以得到序列同一性百分比來計算百分比。
在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中的術語“相同的”或“同一性”是指相同的兩個或更多個序列或子序列(subsequences)。當如使用下列序列比較算法中的一種或通過手工比對并目視檢查所測量而在比較窗口或者指定的區(qū)域比較并比對最大對應時，如果它們具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸殘基(例如，在特定區(qū)域，至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%或至少95%同一性)，序列是彼此“基本上相同的”。這些定義也是指測試序列的互補序列。任選地，同一性存在于至少約50個核苷酸長度的區(qū)域中，或更典型地在100-500個或1000個或更多核苷酸長度的區(qū)域中。
在兩個或更多多肽序列的上下文中，術語“相似性”或“百分比相似性”是指當如使用下列序列比較算法中的一種或通過手工比對并目視檢查所測量而在比較窗口或者指定的區(qū)域比較并比對最大對應時，具有特定百分比相同的或通過保守氨基酸取代定義為相似的氨基酸殘基(例如，在特定區(qū)域內(nèi)60%相似性，任選地65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相似的)的兩個或更多個序列或子序列。如果序列至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，或者至少55%彼此相似，那么它們彼此是“基本上相似的”。任選地，這種相似性存在于至少約50個氨基酸長度的區(qū)域中，或更典型地在至少約100-500個或1000個或更多氨基酸長度的區(qū)域中。
對于序列比較，通常以一個序列作為參照序列，用測試序列與之比較。當使用序列比較算法時，將試驗和參照序列輸入電腦，指定子序列坐標(coordinate)，如果必要，指定序列算法程序參數(shù)。通常使用默認程序參數(shù)，或者可以指定另外的參數(shù)。然后序列比較算法基于程序參數(shù)計算測試序列相對于參照序列的百分比序列同一性或相似性。
如本文使用的，“比較窗口 ”包括涉及選自20-600，通常約50-約200，更通常約100-約150的任一數(shù)量的連續(xù)位置的區(qū)段，其中在兩個序列最佳比對后可以將序列與相同數(shù)量的連續(xù)位置的參照序列比較。用于比較的序列比對方法是本領域公知的?？梢裕?，通過Smith和Waterman的局部同源性算法Appl. Math. 2:482, 1970),通過Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法Mol. Biol. 48:443，1970),通過 Pearson 和Lipman 的搜索相似性法 OdToc. Natl. Acad. Sc1. USA 85:2444，1988),通過這些算法的計算機化執(zhí)行(例如，the Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP, BESTFIT,FASTA,和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.),或者通過手工比對和目測檢查(參見，例如，Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiOlOgyd^tO supplement))實施比較的最佳序列比對。
適合用于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2. 0算法，其分別由 Altschul 等{Nuc. Acids Res. 25:3389-402，1977)和 Altschul 等(J. Mol.Biol. 215:403-10, 1990)描述。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過國立生物技術信息中心(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/)公開地獲得。該算法涉及首先通過在查詢序列中鑒別長度W的短字段來鑒別高評分序列對(HSPs)，其在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度字段比對時匹配或滿足一些陽性值得閾值評分T。T被認為是鄰近字段評分閾值(上述Altschul等)。這些最初的鄰近字段命中作為起始搜索的種子以發(fā)現(xiàn)包含它們的更長HSPs。字段命中沿著各序列雙向延伸，只要累計的比對評分增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎分；始終大于0)和N(錯配殘基的罰分；始終小于0)來計算累計評分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累計評分。字段命中在各方向的延伸停止于累計比對評分從它最大獲得值降低數(shù)量X時；由于一個或更多個負分殘基比對的累積，累計分數(shù)達到或低于0時；或者到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字長(W) 11，期望值(E) 10，M=5, N=-4作為默認值，并比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長3，期望值伍)10，和此03.62評分矩陣(參見Henikoff and Henikoff, ProC. Natl. Acad. Sc1. USA 89:10915，1989)比對(B) 50，期望值(E) 10，M=5, N=-4作為默認值，并比較兩條鏈。
BLAST算法也執(zhí)行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析(參見，例如，Karlin和Altschul, ProC. Natl. Acad. Sc1. USA 90:5873-87，1993)。BLAST 算法提供的一種相似性的量度是最小總和概率(P((N))，其提供兩個核苷酸或氨基酸序列之間匹配偶然發(fā)生的概率的指標。例如，如果在測試核酸與參照核酸的比較中最小總和概率低于約0. 2，典型地低于約0. 01，以及更典型地低于約0. 001，那么該核酸被認為與參照序列是相似的。
術語“錯配辨別力”是指當通過將一個或更多個核苷酸連接(例如共價地)于核酸而以模板依賴方式延伸核酸(例如，引物或其它寡核苷酸)時，生物催化劑(例如酶，如聚合酶、連接酶等)區(qū)分完全互補的序列與包含錯配的序列的能力。術語“3’-錯配辨別力”是指當被延伸的核酸(例如，引物或其它寡核苷酸)與該核酸雜交的模板相比在核酸的3’末端處有錯配時，生物催化劑區(qū)分完全互補的序列與包含錯配(接近互補)的序列的能力。在一些實施方案中，相對于完全互補的序列，被延伸的核酸在3’末端包含錯配。在一些實施方案中，相對于完全互補的序列，被延伸的核酸在倒數(shù)第二(N-1) 3’位置和/在N-2位置包含錯配。
術語“Cp值”或“交叉點”值是指允許定量投入的目標核酸的值。可以根據(jù)二階導數(shù)最大法(the second-derivative maximum method)確定 Cp 值(Van Luu-The,等， “Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using secondderivative calculation and double correction, ” BioTechniques, Vol. 38, No. 2,February 2005, pp. 287術語“PCR效率”是指對于完美匹配的引物模板的循環(huán)至循環(huán)擴增效率的指標。使用公式％ PCR效率=(10(^W)-1) X 100計算每種條件的PCR效率，其中通過y-軸上繪制的對數(shù)拷貝數(shù)和X-軸上繪制的Cp的線性回歸而計算斜率。
術語“多重”是指使用多于一組引物的擴增，或者在單一反應中多于一個多態(tài)性位點的擴增。
附圖簡要說明
圖1顯示來自各種細菌的示例性DNA聚合酶的聚合酶結(jié)構域的區(qū)域的氨基酸序列比對棲熱菌種 ZO5 (ZO5) (SEQ ID NO: 12),水生棲熱菌(Taq) (SEQ ID NO: 13),絲狀棲熱菌(Tfi) (SEQ ID NO: 14),黃棲熱菌(Tfl) (SEQ ID NO: 15),棲熱菌種Spsl7 (Spsl7)(SEQ ID NO: 16)，嗜熱棲熱菌(Tth) (SEQ ID NO: 17)，Thermus caldophilus (Tea)(SEQ ID NO: 18),海棲熱袍菌(Tma) (SEQ ID NO: 19),那不勒斯棲熱袍菌(Tne) (SEQ IDNO:20),非洲棲熱腔菌(Taf) (SEQ ID NO:21),耐放射異常球菌(Dra) (SEQ ID NO:23),嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bst) (SEQ ID NO:24)和熱堅芽孢桿菌(Bca) (SEQ ID NO:25)。此外，顯示的多肽區(qū)域包含氨基酸基序Q-X1-X2-X3-X4-T-G-R-L-S-S (SEQ ID NO:26)，其可變位置在本文中進一步定義。對于每種聚合酶序列，這些基序用粗體突出顯示。適于根據(jù)本發(fā)明的突變的氨基酸位置用星號(*)指出。
圖2提供了下列DNA聚合酶I間的序列同一性棲熱菌種Z05 DNA聚合酶(Z05);水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq);絲狀棲熱菌DNA聚合酶(Tfi);黃棲熱菌DNA聚合酶(Tfl);棲熱菌種Spsl7DNA聚合酶(Spsl7);嗜熱棲熱菌DNA聚合酶(Tth) ; Thermus caldophilusDNA聚合酶(Tca);耐放射異常球菌DNA聚合酶(Dra);海棲熱袍菌DNA聚合酶(Tma);那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶(Tne);非洲棲熱腔菌DNA聚合酶(Taf);嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶(Bst);和熱堅芽孢桿菌DNA聚合酶(Bca)。(A)整個聚合酶I酶(對應于Z05的氨基酸1-834)的序列同一性；和(B)對應Z05的氨基酸420-834的聚合酶亞結(jié)構域的序列同一性。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了改進的DNA聚合酶，其中聚合酶結(jié)構域中一個或多個氨基酸已經(jīng)被鑒別為改進了一種或多種聚合酶活性或特征。相對于除了本文所述氨基酸差異外否則相同的聚 合酶的未修飾形式，本發(fā)明的DNA聚合酶是具有增強的3’ -錯配辨別力活性的活性酶(即，本文所述的創(chuàng)造性的聚合酶延伸在引物的3’末端處或附近與模板錯配的該引物的可能性更小)。DNA聚合酶在涉及多核苷酸延伸或多核苷酸模板的擴增的多種應用(包括，例如在重組DNA研究和疾病的醫(yī)療診斷中的應用)中是有用的。
本發(fā)明的聚合酶
在一些實施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序Gln-X1-X2-X3-X4-Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser (在本文中也用單字母代碼稱為Q-X1-X2-X3-X4-T-G-R-L-S-S);其中X1 是 Thr (T)或 Ala (A)；
X2 是 Ala (A)，Gly (G)或 Leu (L)；
X3 是 Thr (T)或 Val (V)；
X4是除Ala (A)，Ser (S)或Gln (Q)以外的任何氨基酸(SEQ ID N0:8)。
在一些實施方案中，X4選自 G，L, M, W, P，T, F，Y，C，N，D, E, V, I, R,K 或H (SEQ ID NO:42)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序(對應于棲熱菌和棲熱袍菌)
Gln-Thr-X2-Thr-X4-Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser (在本文中也用單字母代碼稱為Q-T-X2-T-X4-T-G-R-L-S-S);其中X2 是 Ala (A)或 Gly (G)；
X4是除Ala (A)以外的任何氨基酸(SEQ ID N0:9)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序 Gln-Thr-Ala-Thr-X4-Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser (在本文中也用單字母代碼稱為
Q-T-A-T-X4-T-G-R-L-S-S);其中
X4是除Ala (A)以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 10)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序 Gln-Thr-Ala-Thr-X4-Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser (在本文中也用單字母代碼稱為
Q-T-A-T-X4-T-G-R-L-S-S);其中 X4 是 Asp (D) (SEQ ID NO: 11)。
這種基序存在于許多家族A型DNA依賴的DNA聚合酶，尤其是來自嗜熱菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的“手指”結(jié)構域中(Li等.，EMBO J. 17:7514-7525, 1998)。例如，圖1顯示了包含對應于來自下列各種細菌的DNA聚合酶中上述基序的天然序列的氨基酸序列比對大腸桿菌，熱堅芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，耐放射異常球菌，非洲棲熱腔菌，海棲熱袍菌，那不勒斯棲熱袍菌，水生棲熱菌，Thermus caldophilus, 激巍，黃棲熱菌，棲熱菌種Spsl7，棲熱菌種Z05和嗜熱棲熱菌。如所示，SEQ ID NO 8 (除了其中X4是八，S或Q)的基序，存在于這些聚合酶中間的每一個中，表明對于聚合酶的該區(qū)域的保守功能。圖2提供了這些DNA聚合酶間的序列同一性。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID勵8，9，10，或11(例如，其中X4選自G，L, M, W, P，T, F，Y，C，N，D, E, V, I, R, K或H)并具有本文所述的改進的活性和/或特征的聚合酶，其中所述DNA聚合酶或者是野生型或天然存在的DNA聚合酶，如，例如，來自上面列出的嗜熱細菌的任一種的DNA聚合酶，或者與這種野生型或天然存在的DNA聚合酶基本上相同的DNA聚合酶。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的聚合酶包括 SEQ ID NO :8，9，10 或 11，與 SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6，7，36，37，38，39，40或41至少80 %，85 %，90 %或95 %相同。在一個變型中，聚合酶的未修飾的形式來自于棲熱菌種。在本發(fā)明的一些實施方案中，未修飾的聚合酶來自除棲熱菌以外的嗜熱菌種，例如棲熱袍菌。許多熱穩(wěn)定DNA聚合酶的完整的核酸和氨基酸序列是可獲得的。PCT國際專利公開號WO 92/06200中已經(jīng)公布了水生棲熱菌(Taq) (SEQ ID N0:2)、嗜熱棲熱菌(Tth)(SEQ ID N0:6)、棲熱菌種 Z05(SEQ ID NO:1)、棲熱菌種 Spsl7 (SEQ ID NO: 5)、海棲熱袍菌(Tma) (SEQ ID NO:38)和非洲棲熱腔菌(Taf) (SEQ ID NO:37)聚合酶中每一種的序列。Akhmetz janov 和 Vakhitov (/Vwc7<9icTfesearcA 20:5839，1992)已經(jīng)公布了來自黃棲熱菌的DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:4) o來自Thermus的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的序列(SEQ ID N0:7)在EMBL/GenBank登錄號U62584發(fā)現(xiàn)。來自絲狀棲熱菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的序列可以使用例如美國專利號4，889，818提供的方法以及表I中提供的序列信息從ATCC保藏號42380中重新獲得。那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶的序列(SEQID NO: 39)來自GeneSeq專利數(shù)據(jù)庫登錄號R98144和PCT WO 97/09451。例如Uemori等(J BioChem(Tokyo) 113 (3) :401-410, 1993描述了來自熱堅芽孢桿菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的序列(SEQ ID N0:41);也參見Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫登錄號Q04957以及GenBank登錄號D12982 和 BAA02361)。例如，美國專利號 6，228，628; 6, 346, 379; 7, 030, 220; 6, 881, 559; 6, 794, 177; 6,468,775 ;和美國專利申請?zhí)?20040005599; 20020012970; 20060078928;20040115639中也描述了可以如本文所述修飾的DNA聚合酶的未修飾的形式的例子。序列表中還提供了代表性的全長聚合酶序列。
在一些實施方案中，本發(fā)明的以及具有包含SEQ ID N0S:8，9，10或11的聚合酶結(jié)構域的聚合酶也包含核酸酶結(jié)構域(例如，對應于Z05的1-291位)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的聚合酶是嵌合的聚合酶，即，包含來自兩種或更多種酶的多肽區(qū)域。例如美國專利號6，228，628描述了這種嵌合DNA聚合酶的例子。特別合適的是嵌合CS家族DNA聚合酶，其包括CS5 (SEQ ID NO: 29)和CS6 (SEQ ID NO: 30)聚合酶及其與SEQ ID N0:29或SEQ ID NO:30具有基本上的序列同一性或相似性的變體(典型地至少80%序列同一性，更典型地至少90%，最典型地至少95%序列同一性)，因此可以被修飾為包含SEQ ID N0:8。CS5和CS6 DNA聚合酶是源自棲熱菌種Z05和海棲熱袍菌(Ma)DNA聚合酶的嵌合酶。它們包括棲熱菌酶的N-末端的5’ -核酸酶結(jié)構域和Tma酶的C-末端的3’ -5’核酸外切酶以及聚合酶結(jié)構域。這些酶具有有效的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可以延伸包含核苷酸類似物的引物，并可以利用a -硫代磷酸酯dNTPs、dUTP、dITP以及熒光素和花菁染料家族標記的dNTPs。CS5和CS6聚合酶也是有效的Mg2+活化的PCR酶。例如，美國專利申請公開號2004/0005599中進一步描述了 CS5和CS6嵌合聚合酶。
在一些實施方案中，本發(fā)明的聚合酶包括SEQ ID NO :8，9，10或11，并進一步包含與天然的聚合酶相比的一個或多個額外的氨基酸變化(例如，通過氨基酸取代，增加或缺失)。在一些實施方案中，這種聚合酶保留了 SEQ ID NO :8的氨基酸基序(或SEQ ID NO:9,10或11的基序)，并進一步包含如下的SEQ ID N0:27的氨基酸基序(對應于Z05 (SEQ IDNO 1)的 D580X 突變)
T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N ;其中
X7 是 Ser (S)或 Thr (T);和
X8除D或E以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 27)。
例如，美國專利公開號2009/0148891中更詳細地討論了由SEQ ID NO 27表征的突變。在一些實施方案中，這種功能性變體聚合酶通常與野生型或天然存在的聚合酶(例如，SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6，7，39，40，41，42，43 或 44)具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80%序列同一性，更典型地至少90%，最典型地至少95%序列同一I"生。
在一些實施方案中，如SEQ ID NO:8，9，10或11中所述用氨基酸取代X4位的氨基酸，如SEQ ID NO: 27中所述用氨基酸取代X8位的氨基酸。因此，在一些實施方案中，X4位的氨基酸是除Ala (A)以外的任何氨基酸，X8位的氨基酸是除Asp (D)或Glu (E)以外的任何氨基酸。在一些實施方案中，氨基酸取代包括在SEQ ID N0:27的X8位的亮氨酸(L)，甘氨酸(G)，蘇氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，天冬酰胺(N)，精氨酸(R)和賴氨酸(K)。在某些實施方案中，氨基酸取代獨立地包括X4位的Asp (D)以及X8位的甘氨酸(G)?？梢允褂?，例如，定點誘變的已知方法和本文中進一步描述的測定中多核苷酸延伸性能的確定方法或本領域技術人員已知的其它方法確定在一個或多個鑒別的位點的其它合適的氨基酸取代。
因為DNA聚合酶的精確長度變化，對應于X4和X8的每一個的精確的氨基酸位置可以根據(jù)使用的特定聚合酶而變化。氨基酸和核酸序列比對程序是容易獲得的(見，例如，上文提到的那些)，考慮到本文鑒別的特定基序，所述程序用來幫助鑒別用于本發(fā)明一致的修飾的正確的氨基酸(和對應的密碼子)。對于來自示例性的嗜熱菌種的代表性的嵌合的熱穩(wěn)定DNA聚合酶和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,對應于X4和X8中每一個的位置如表I中所不。
表1.對應于示例性聚合酶中基序位置(例如，SEQ ID N0S:8，9，10和11的)X4和(SEQ ID NO: 27的)X8的氨基酸位置。
權利要求
1.DNA聚合酶，與對照DNA聚合酶相比，所述DNA聚合酶具有增強的3’ -錯配辨別力活性，其中對應于SEQ ID NO:1的572位的DNA聚合酶的氨基酸是除A、S或Q以外的任何氨基酸，其中除了對應于SEQ ID NO:1的572位的所述對照DNA聚合酶的氨基酸是A、S或Q，所述對照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。
2.權利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶結(jié)構域中包含基序，所述基序包含 Q-XfXa-Xg-XA-T-G-R-L-S-S，其中 X1是T或A ;
X2 是 A、G 或 L ; X3是T或V ; X4是除A、S或Q以外的任何氨基酸(SEQ ID N0:8)。
3.權利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶結(jié)構域中包含基序，所述基序包含 Q-T-X2-T-X4-T-G-R-L-S-S,其中 X2是A或G ; X4是除A以外的任何氨基酸(SEQ ID N0:9)。
4.權利要求
1的DNA聚合酶，在聚合酶結(jié)構域中包含基序，所述基序包含 Q-T-A-T-X4-T-G-R-L-S-S,其中 X4是除A以外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 10)。
5.權利要求
4的DNA聚合酶，其中X4是D(SEQ ID NO: 11)。
6.權利要求
1-5中任一項的DNA聚合酶，其中對應于SEQID NO:1的580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。
7.權利要求
1-6中任一項的DNA聚合酶，其中對應于SEQID NO:1的580位的氨基酸選自 L、G、T、Q、A、S、N、R、和 K。
8.權利要求
1-7中任一項的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含與SEQID ΝΟ:1、2、3、4、5、6、7、36、37、38、39、40或41至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%序列相同的氨基酸序列。
9.權利要求
6或7中任一項的DNA聚合酶，其中所述聚合酶與SEQID NO:1具有至少80%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%的序列同一'丨生。
10.權利要求
9的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是Z05DNA聚合酶，所述580位的氨基酸選自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。
11.重組核酸,其編碼權利要求
1-10中任一項的DNA聚合酶。
12.進行引物延伸的方法，包括 在適于引物延伸的條件下將權利要求
1-10中任一項的DNA聚合酶與引物、多核苷酸模板和三磷酸核苷接觸，從而產(chǎn)生延伸的引物。
13.產(chǎn)生延伸的引物的試劑盒，包括 至少一個提供權利要求
1-10中任一項的DNA聚合酶的容器。
14.權利要求
13的試劑盒，進一步包括一個或更多個額外的容器，所述容器選自 (a)容器，其提供在引物延伸條件下與預定的多核苷酸模板可雜交的引物； (b)容器，其提供三磷酸核苷；以及 (c)容器，其提供適合用于引物延伸的緩沖劑。
15.反應混合物，包含權利要求
1-10中任一項的DNA聚合酶，至少一種引物，多核苷酸模板和三磷酸核苷。
專利摘要
本發(fā)明公開了相對于對應的未修飾的聚合酶具有增強的3′-錯配辨識力的突變型DNA聚合酶。突變型聚合酶可用于多種公開的引物延伸方法中。還公開了相關的組合物，包括可用于，例如，突變型DNA聚合酶生產(chǎn)的重組核酸、載體以及宿主細胞。
文檔編號C12N9/12GKCN103025867SQ201180036355
公開日2013年4月3日 申請日期2011年6月17日
發(fā)明者F.賴切特, K.鮑爾, T.W.邁爾斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan