專利名稱:一種促進(jìn)樟芝活性產(chǎn)物Antrodin C生物合成的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)樟芝活性產(chǎn)物Antrodin C生物合成的發(fā)酵方法,尤其是一種通過(guò)兩階段溶氧或溶氧與pH相結(jié)合的策略提高活性產(chǎn)物Antrodin C生物合成的方法。
技術(shù)背景
樟芝(Antrodia camphorata)屬于多孔菌科、薄孔菌屬，是我國(guó)臺(tái)灣特有的珍稀藥用真菌。長(zhǎng)期以來(lái)，樟芝被用作解酒保肝的傳統(tǒng)藥，用于治療肝臟疾病，食物和藥物所引起的中毒癥狀以及腹瀉，腹痛，高血壓，皮膚發(fā)庠和腫瘤疾病等。大量文獻(xiàn)研究表明，樟芝具有保肝、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗高血壓高血脂、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等生物活性。
由于樟芝的寄主專一性特別強(qiáng)，而其唯一寄主牛樟樹非常稀少且生長(zhǎng)緩慢，樟芝野生子實(shí)體非常難得，而椴木栽培法生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，難以彌補(bǔ)市場(chǎng)的巨大需求。因此，發(fā)酵法生產(chǎn)樟芝活性產(chǎn)物將是一種有效地方法。目前通過(guò)樟芝細(xì)胞深層液態(tài)發(fā)酵已較成功的實(shí)現(xiàn)了樟芝菌體快速人工培養(yǎng)?，F(xiàn)代研究表明，樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物在治療各種肝病方面具有較好的功效。Nakamura (NAKAMURA N, HIRAKAffA A, SHEU C C，et al. Five NewMaleic and Succinic Acid Derivatives from the Mycelium of Antrodia camphorataand Their Cytotoxic Effects on LLC Tumor Cell Line[J]. Journal of Natureproduct,67 46-48.)等人從樟芝液態(tài)發(fā)酵菌體中分離得到五種新的馬來(lái)酸和琥珀酸衍生物(Antrodin A-E)，是液態(tài)發(fā)酵樟芝菌體中的主要活性成分，具有顯著的抗肝炎活性，其中Antrodin B和Antrodin C對(duì)LLC癌癥細(xì)胞具有良好的抑制效果。Phuong(PHU0NGT, MA C M, HATTORI M, et al.1nhibitory effects of antrodins A-E from Antrodiacamphorata and their metabolites on hepatitis C virus protease[J]. PhytotherRes, 2009, 23 (4) :582_584.)研究結(jié)果顯示樟芝菌絲體中含有的Antrodin A-E對(duì)HCV病毒都具有很好的抑制活性，其中Antrodin A抑制能力最高；研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)AntrodinC可以轉(zhuǎn)化為Antrodin A，從 而展現(xiàn)良好的保肝活性。Lee(Lee TH，Lee CK, Tsou WL,et al. A New Cytotoxic Agent from Solid-state Fermented Mycelium of Antrodiacamphorata[J]. Planta Letter，2007.)等人用正己焼萃取樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末，得到一個(gè)新化合物(Antroquinonol)，屬于泛醌類化合物，實(shí)驗(yàn)表明對(duì)乳腺癌、肝癌和前列腺癌等多種癌細(xì)胞具有良好的抗癌效果，同時(shí)具有抑制HBsAg和HBeAg合成的潛力，從而抑制HBV的復(fù)制。
Shu(SHU C H,LUNG M Y. Effect of pH on the production and molecular weightdistribution of exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures[J].Process Biochemistry，2004，39 :
931-937.)等人報(bào)道了兩階段pH控制對(duì)樟芝液態(tài)發(fā)酵的影響，但該方法只報(bào)道了胞外多糖的生產(chǎn)情況，所公開的最大胞外多糖產(chǎn)量為148mg/L。Shih(SHIH I L，PAN K，HSIEH C.1nfluence of nutritional components and oxygen supply on the mycelialgrowth and bioactive metabolites production in submerged culture of Antrodiacinnamomea[J]. Process Biochemistry, 2006,41 :1129_1135.)等報(bào)道了培養(yǎng)基組成和溶氧對(duì)樟芝液態(tài)發(fā)酵的影響，但是該方法主要研究了對(duì)樟芝胞內(nèi)多糖和胞外多糖合成的影響。同時(shí)，上述方法并沒(méi)有根據(jù)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)外核層所需要的環(huán)境條件(如PH和溶氧)的差異性，采用相應(yīng)的組合控制策略分別促進(jìn)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。
公開號(hào)為CN1456661A (發(fā)明名稱樟芝大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝)、CN101803528A(—種樟芝菌絲體的新穎培養(yǎng)方法)等專利文獻(xiàn)公開了一系列的通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)樟芝的細(xì)胞培養(yǎng)方法，但上述文獻(xiàn)中所公開的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物均為樟芝菌絲體或是多糖，并沒(méi)有關(guān)于樟芝菌絲體特征活性產(chǎn)物Antrodin (A-E)類化合物的生產(chǎn)方法報(bào)道，也沒(méi)有關(guān)于誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol類化合物的調(diào)控方法報(bào)道。由于富含生理活性物質(zhì)的樟芝產(chǎn)品的需求與日俱增，急需一種特殊的大規(guī)模人工培養(yǎng)樟芝的方法，該方法可以有針對(duì)性地提高樟芝特征活性產(chǎn)物Antrodins和Antroquinonol類化合物的含量，以提高樟芝產(chǎn)品品質(zhì)，滿足市場(chǎng)的不斷更新發(fā)展。而根據(jù)我們查新報(bào)告表明，目前并沒(méi)有關(guān)于樟芝特征活性產(chǎn)物Antrodins和Antroquinonol的培養(yǎng)方法及過(guò)程優(yōu)化的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種促進(jìn)樟芝活性產(chǎn)物Antrodin C生物合成的發(fā)酵方法，以顯著提高樟芝特征活性產(chǎn)物Antrodin C的產(chǎn)量。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案包括斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，其中深層液態(tài)發(fā)酵采用兩階段控制，第一階段控制溶氧在20%以上，第二階段控制溶氧在6-15%，發(fā)酵溫度為18°C -28°C。
所述第一階段的培養(yǎng)時(shí)間為0-5天。
為更好的解決技術(shù)問(wèn)題，還可將溶氧兩階段控制策略與pH兩階段控制相結(jié)合，第一階段PH值控制為3. 0-4. 5，第二階段pH值控制為4. 5-7. 0，優(yōu)選為4. 5-6. O。
本發(fā)明中，所述的樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)可以是已知的任何一種適合樟芝生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，液體深層發(fā)酵所用到的培養(yǎng)基組成成分也是適合樟芝培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
作為參考
所述的斜面培養(yǎng)基是PDA (potato dextrose agar):樟芝斜面菌種培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間為12天。
所述的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖20，Na2HPO4 O. 5，MgSO4O. 5，檸檬酸O. 5，黃豆粉4，玉米漿粉2。一級(jí)液體種子培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，培養(yǎng)時(shí)間4d。
所述的二級(jí)液體種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖20，Na2HPO4 O. 5，MgSO4O. 5，檸檬酸O. 5，黃豆粉4，玉米漿粉2。二級(jí)液體種子培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
所述的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖60，Na2HPO4 O. 5，MgSO4O. 5，黃豆粉8，玉米漿粉2。液體深層發(fā)酵溫度條件28 °C。
所述的樟芝菌株來(lái)源于臺(tái)資企業(yè)上海福茂食用菌有限公司。菌種來(lái)源可參考中國(guó)專利201010164142. 3，已公開。
Antrodin C采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分析。取粉碎的樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末O. 5g，加入60ml乙醇，50°C，振蕩萃取1. 5h，靜置后取上清經(jīng)過(guò)O. 22 μ m濾膜微濾，進(jìn)行HPLC 分析。分析條件如下:色譜柱Sepax Amethyst C18 (4. 6mmX 250mm);流速lmL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm ;流動(dòng)相A 7jC /乙酸=100/0. 5,流動(dòng)相B :乙腈；洗脫梯度如下0-10min,流動(dòng)相 B 35% -50% ;10-35min，流動(dòng)相 B 50% -60% ;35_50min，流動(dòng)相 B 60% -80% ；50-60min，流動(dòng)相 B 80% -100%。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案技術(shù)工藝簡(jiǎn)單、高效，能顯著提高樟芝菌體特征活性產(chǎn)物AntrodinC的產(chǎn)量，同時(shí)可誘導(dǎo)Antroquinonol類化合物合成,有著重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)對(duì)樟芝其他活性代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有一定的啟迪意義。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)驗(yàn)旨在考察樟芝液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中不控制溶氧濃度和pH值時(shí)，其對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
1、樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)按照以下培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行
所述的斜面培養(yǎng)基是PDA (potato dextrose agar);樟芝斜面菌種培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間為12天。
所述的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖20，Na2HPO4 O. 5，MgSO4 O. 5，檸檬酸O. 5，黃豆粉4，玉米漿粉2。一級(jí)液體種子培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，培養(yǎng)時(shí)間4d。
所述的二級(jí)液體種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖20，Na2HPO4 0. 5，MgSO4 0. 5，檸檬酸0. 5，黃豆粉4，玉米漿粉2。二級(jí)液體種子培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
2、液體深層發(fā)酵
在5L機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器中進(jìn)行液體深層發(fā)酵。所述的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖60，Na2HPO4 0. 5, MgSO4 0. 5，黃豆粉8，玉米漿粉2。液體深層發(fā)酵溫度條件28°C。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最大生物量為14. 2g/L, Antrodin C最大含量為169. 5mg/L，沒(méi)有檢測(cè)得到 Antroquinonol。
實(shí)施例2
本實(shí)驗(yàn)旨在考察液態(tài)發(fā)酵體系采用溶氧兩階段控制時(shí)對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
本實(shí)施例中，樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)以及深層液態(tài)發(fā)酵完全同實(shí)施例1 ;在發(fā)酵的第一階段(前5天)控制溶氧濃度在20%，在發(fā)酵的第二階段(第5天起)控制溶氧濃度在10%，控制發(fā)酵溫度為28°C。用此溶氧兩階段控制培養(yǎng)樟芝，最大生物量為13. 7g/L，Antrodin C最大含量為217. 3mg/L，檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol,其含量為 13. 4mg/L。
實(shí)施例3
本實(shí)驗(yàn)旨在考察液態(tài)發(fā)酵體系采用溶氧兩階段控制時(shí)對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
本實(shí)施例中，樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)以及深層液態(tài)發(fā)酵完全同實(shí)施例1 ;在發(fā)酵的第一階段(前5天)控制溶氧濃度在20 %以上，在發(fā)酵的第二階段(第5天起)控制溶氧濃度在6%，控制發(fā)酵溫度為18°C。用此溶氧兩階段控制培養(yǎng)樟芝，最大生物量為11. 2g/L，Antrodin C最大含量為173. 6mg/L，檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol,其含量為 5. 3mg/L。
實(shí)施例4
本實(shí)驗(yàn)旨在考察液態(tài)發(fā)酵體系采用溶氧兩階段控制時(shí)對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
本實(shí)施例中，樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)以及深層液態(tài)發(fā)酵完全同實(shí)施例1 ;在發(fā)酵的第一階段(前5天)控制溶氧濃度在20%，在發(fā)酵的第二階段(第5天起)控制溶氧濃度在15%，控制發(fā)酵溫度為28°C。用此溶氧兩階段控制培養(yǎng)樟芝，最大生物量為12. 6g/L，Antrodin C最大含量為239. 7g/L，檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol,其含量為 11. 5mg/L。
實(shí)施例5本實(shí)驗(yàn)旨在考察液態(tài)發(fā)酵體系采用pH兩階段控制時(shí)對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
本實(shí)施例中，樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)以及深層液態(tài)發(fā)酵完全同實(shí)施例1 ;在發(fā)酵的第一階段(前5天)控制發(fā)酵液pH在4.0，在發(fā)酵的第二階段(第5天起)控制發(fā)酵液pH在4. 5，控制發(fā)酵溫度為25°C。用此pH兩階段控制培養(yǎng)樟芝，最大生物量為12. 4g/L，Antrodin C最大含量為197. 3mg/L，檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol,其含量為 6. 4mg/L。
實(shí)施例6
本實(shí)驗(yàn)旨在考察液態(tài)發(fā)酵體系將溶氧兩階段和pH兩階段控制協(xié)同在一起時(shí)對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
本實(shí)施例中，樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)以及深層液態(tài)發(fā)酵完全同實(shí)施例1 ;在發(fā)酵的第一階段(前5天)控制發(fā)酵液pH在4.0，同時(shí)控制發(fā)酵液的溶氧濃度為20% ;在發(fā)酵的第二階段(第5天起)控制發(fā)酵液pH在4.5，同時(shí)控制發(fā)酵液的溶氧濃度為10%，控制發(fā)酵溫度為201。用此溶氧兩階段和pH兩階段協(xié)同控制培養(yǎng)樟芝，最大生物量為12. 7g/L，Antrodin C最大含量為243. 6mg/L，檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol,其含量為 16. 3mg/L。
實(shí)施例7
本實(shí)驗(yàn)旨在考察液態(tài)發(fā)酵體系將溶氧兩階段和pH兩階段控制協(xié)同在一起時(shí)對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
本實(shí)施例中，樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)以及深層液態(tài)發(fā)酵完全同實(shí)施例1 ;在發(fā)酵的第一階段(前5天)控制發(fā)酵液pH在4. 0，同時(shí)控制發(fā)酵液的溶氧濃度為20% ;在發(fā)酵的第二階段(第5天起)控制發(fā)酵液pH在6.0，同時(shí)控制發(fā)酵液的溶氧濃度為10%，控制發(fā)酵溫度為27°C。用此溶氧兩階段和pH兩階段協(xié)同控制培養(yǎng)樟芝，最大生物量為12.1 g/L, Antrodin C最大含量為271. 8mg/L，檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol,其含量為 12. 2mg/L。
實(shí)施例8[0047]本實(shí)驗(yàn)旨在考察液態(tài)發(fā)酵體系將溶氧兩階段和pH兩階段控制協(xié)同在一起時(shí)對(duì)樟芝細(xì)胞生長(zhǎng)及活性產(chǎn)物合成的影響。
本實(shí)施例中，樟芝斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)以及深層液態(tài)發(fā)酵完全同實(shí)施例1 ;在發(fā)酵的第一階段(前5天)控制發(fā)酵液pH在4. 0，同時(shí)控制發(fā)酵液的溶氧濃度為20% ;在發(fā)酵的第二階段(第5天起)控制發(fā)酵液pH在7.0，同時(shí)控制發(fā)酵液的溶氧濃度為10%，控制發(fā)酵溫度為18°C。用此溶氧兩階段和pH兩階段協(xié)同控制培養(yǎng)樟芝，最大生物量為10. 3g/L，Antrodin C最大含量為229. 4mg/L，檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生Antroquinonol,其含量為 9. 3mg/L。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求
書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)樟芝活性產(chǎn)物Antrodin C生物合成的發(fā)酵方法,其特征在于采用溶氧兩階段控制的液體深層發(fā)酵，第一階段控制溶氧在20%以上，第二階段控制溶氧在6-15%，發(fā)酵溫度為18°C_28°C;所述第一階段的培養(yǎng)時(shí)間為0-5天；所述液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖60，Na2HPO4O. 5，MgSO4O. 5，黃豆粉8，玉米漿粉2。
2.權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于還包括pH兩階段控制，第一階段pH值控制為 3.0-4. 5，第二階段pH值控制為4. 5-7. 0。
3.權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所述第二階段pH值優(yōu)選為4.5-6.0。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)樟芝活性產(chǎn)物Antrodin C生物合成的發(fā)酵方法包括斜面菌種培養(yǎng)、一級(jí)液體種子培養(yǎng)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，其中深層液態(tài)發(fā)酵采用兩階段控制，第一階段控制溶氧在20％以上，第二階段控制溶氧在6-15％，發(fā)酵溫度為18℃-28℃；此外，還可采用溶氧與pH相協(xié)同的發(fā)酵方法，通過(guò)兩階段pH及溶氧混合控制，能顯著促進(jìn)樟芝活性產(chǎn)物Antrodin C的合成，最高含量達(dá)271.8mg/L。本發(fā)明所提供控制技術(shù)工藝簡(jiǎn)單、高效，有著重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)對(duì)樟芝其他活性代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有一定的啟迪意義。
文檔編號(hào)C12P7/26GKCN102321684 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110303813
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月9日
發(fā)明者許贛榮, 夏永軍, 喻學(xué)淳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),