一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其方法包括樟芝發(fā)酵全液或發(fā)酵后澄清液或菌絲體經(jīng)過加熱過濾、減壓濃縮、醇析、離心分離、收集物干燥、收集物粉碎等步驟。本發(fā)明的方法提取的樟芝菌絲體發(fā)酵全液活性物質(zhì)對禽流感病毒具有明顯的抑制作用，該方法具有工藝簡便、產(chǎn)量高、成本低、藥效好的特點(diǎn)。
【專利說明】一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法
[0001](一)【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，尤其涉及樟芝(An trodi a camphora ta ) AcOO I,已于2005年9月21日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC N0.1460。
[0002](二)【背景技術(shù)】
關(guān)于抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，經(jīng)檢索到的相關(guān)專利有:中國專利申請?zhí)枮?9112556.8灰樹花發(fā)酵液多糖提取方法，02136517.2灰樹花發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，89105471 —種云芝糖肽(PSP)的生產(chǎn)方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工藝，96109095中國靈芝保健飲料，92111030靈芝營養(yǎng)保健液及其制法，93103116靈芝口服液等專利，這些專利內(nèi)容大多以提取多糖為主要目的，其中灰樹花、云芝和靈芝三種制備的活性物質(zhì)提取物具有抗腫瘤、抗高血壓、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等藥效，但對于抗病毒作用鮮有報(bào)道，而對于抗禽流感病毒的報(bào)道更是沒有檢索到。
[0003](三)
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明要解決的問題是，針對上述抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法以及其制備的發(fā)酵液提取物的藥理作用所存在的不足，提供一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法。利用本發(fā)明的方法提取的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)對禽流感病毒具有明顯的抑制作用，并且對正常細(xì)胞具有保護(hù)作用，且該方法具有工藝簡便、產(chǎn)量高、成本低的特點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，包括三種制備形式:其一為直接從樟芝發(fā)酵全液包括菌絲體與澄清液中分離出活性物質(zhì)；其二為先將樟芝發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，再從所得菌絲體中分離出活性物質(zhì)；其三為先將樟芝發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，`再從所得澄清液中分離出活性物質(zhì)。由以下步驟組成:
所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征是，所述樟芝菌絲體發(fā)酵全液提取物由下述方法制得:
(1)加熱提取:取經(jīng)液體發(fā)酵的樟芝發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液放于容器內(nèi)，調(diào)整其pH值為8~12，置60~120°C下加熱100~240分鐘，
(2)過濾:之后冷卻、以180~200目的篩網(wǎng)過濾樟芝發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液，收集濾液，濾渣以其4~8倍體積的蒸餾水稀釋，重復(fù)上述操作I~2遍，再收集濾液；
(3)減壓濃縮:離心完畢后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度50~70°C，壓力0.2~
0.6Kg/cm2,真空度為0.02~0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10 ~1/20 ；
(4)醇析:在濃縮濾液中，加入量為其體積4~8倍的醇溶液并不斷攪拌，攪拌速度為60r/min, 10~20分鐘后，靜置24~48小時(shí)進(jìn)行醇析；
(5)離心分離:醇析后棄上清液，沉淀物移入離心管中，以轉(zhuǎn)速為3000~5000r/min離心20~30min，離心后棄去上清液，收集離心沉淀物；(6)收集物干燥:將上述收集的離心沉淀物，在50~70°C溫度條件下干燥36~48小
時(shí)；
(7)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過篩后，即為樟芝抗禽流感病毒活性物質(zhì)提取物。其中，步驟111所述的樟芝發(fā)酵全液是指樟芝(也camphorata')發(fā)酵液與菌絲體的集合體。
[0005]步驟[I)所述的樟芝澄清液是指樟芝(An trodi a camphora ta )發(fā)酵后澄清液。
[0006]步驟[I)所述的樟芝菌絲體是指樟芝(Antrodia)菌株發(fā)酵所得菌絲體 所述樟芝通過以下步驟進(jìn)行發(fā)酵:
(1)液體種子培養(yǎng):采用500毫升三角瓶，每瓶裝200毫升液體培養(yǎng)基，將10%的樟芝菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，調(diào)節(jié)PH為3-8，培養(yǎng)溫度為20-35°C，搖瓶轉(zhuǎn)速為80-280r/min，培養(yǎng)7_15天，即可得到樟芝液體種子；
(2)發(fā)酵罐發(fā)酵:先將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.1~0.2公斤/平方厘米，滅菌時(shí)間為1-2小時(shí)；當(dāng)樟芝液體種子pH值降至2.5-4時(shí)，將搖瓶中的樟芝種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，調(diào)整pH為5-8，培養(yǎng)溫度25-35°C，通氣量0.5-1.lvvm,攪拌轉(zhuǎn)速100-250r/min,培養(yǎng) 7-30 天。
[0007]所述液體種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
馬鈴薯淀粉 I~3%麥芽糖I~5%
蛋白胨0.2~0.6%酵母膏`0.2~0.5%
硫酸鎂0.1~0.3%磷酸二氫鉀 0.05~0.1%
采用本發(fā)明的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，具有工藝簡便、產(chǎn)量高、成本低的特點(diǎn)。該方法采用樟芝菌絲體的發(fā)酵液、菌絲體及其發(fā)酵全液進(jìn)行活性物質(zhì)提取,大大解決了樟芝子實(shí)體及菌絲體人工培養(yǎng)的難度、降低了原料成本、生產(chǎn)成本，增加了產(chǎn)量，提高了產(chǎn)率。
[0008]采用本發(fā)明的方法提取的樟芝活性物質(zhì)，經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用真菌研究所在中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心外來病研究中心所作的體外抗禽流感病毒藥物篩選試驗(yàn)，樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)對禽流感病毒具有較強(qiáng)的抑制作用，并對細(xì)胞具有保護(hù)作用。
[0009]體外抗禽流感病毒藥物篩選試驗(yàn)的具體方法如下:
1、實(shí)驗(yàn)材料
1、細(xì)胞:MDCK細(xì)胞
2、病毒:禽流感病毒毒株為H5N1型
3、培養(yǎng)液:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液
I1、實(shí)驗(yàn)條件 生物安全三級實(shí)驗(yàn)室
II1、實(shí)驗(yàn)步驟
1、CPE法測定病毒對MDCK細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TCID50)
按Reed-Muench法測定MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞感染物感染劑量(TCID50)。
[0010]2、CPE法結(jié)合MTT法確定藥物對細(xì)胞的無毒濃度
用酶聯(lián)免疫檢測儀測定0D492值，計(jì)算出樣品的最大無毒濃度(TCO)和半數(shù)中毒濃度(EC50)。
[0011]3、提取物的最大無毒濃度對禽流感病毒的藥效測定
采用MTT法測定0D492值。當(dāng)加樣組的0D492值顯著大于病毒對照組0D492時(shí)，表明此樣液能夠顯著抑制病毒感染MDCK，具有抗病毒的活性。
[0012]IV、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、病毒的 TCID5。為 10_4。
[0013]2、取去樟芝提取物5個(gè)濃度即16、8、4、2、和Img / ml進(jìn)行細(xì)胞毒性測定，每濃度做10個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照。結(jié)果顯示最大無毒濃度為16 mg / ml ο
[0014]3、取32、16、8、0.8mg / ml藥液，做10個(gè)復(fù)孔，觀察對禽流感病毒的抑制作用。試驗(yàn)設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照。結(jié)果顯示樟芝提取物4個(gè)不同濃度藥物對禽流感病毒具有很好的抑制作用。見下表。
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征是，所述樟芝菌絲體發(fā)酵全液活性物質(zhì)由下述方法制得: ID加熱:取經(jīng)液體發(fā)酵的樟芝發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液放于容器內(nèi)，調(diào)整其PH值為8~12，置60~120°C下加熱100~240分鐘； (62'過濾:之后冷卻、以180~200目的篩網(wǎng)過濾樟芝發(fā)酵全液或菌絲體或澄清液，收集濾液，濾渣以其4~8倍體積的蒸餾水稀釋，重復(fù)上述操作I~2遍，再收集濾液； ⑶減壓濃縮:離心完畢后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度50~70°C，壓力0.2~0.6Kg/cm2,真空度為0.02~0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10 ~1/20 ； ⑷醇析:在濃縮濾液中，加入量為其體積4~8倍的醇溶液并不斷攪拌，攪拌速度為60r/min, 10~20分鐘后，靜置24~48小時(shí)進(jìn)行醇析； c離心分離:醇析后棄上清液，沉淀物移入離心管中，以轉(zhuǎn)速為3000~5000r/min離心15~30min，離心后棄去上清液，收集離心沉淀物； (6)收集物干燥:將上述收集的離心沉淀物，在50~70°C溫度條件下干燥4~48小時(shí)； (7)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過篩后，即為樟芝抗禽流感病毒活性物質(zhì)提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征在于所述樟芝發(fā)酵全液經(jīng)分離獲得樟芝發(fā)酵菌絲體和樟芝發(fā)酵澄清液。`
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌絲體發(fā)酵全液提取物的制備方法，其特征在于，所述樟芝發(fā)酵全液通過以下步驟獲得: (1)液體種子培養(yǎng):采用500毫升三角瓶，每瓶裝200毫升液體培養(yǎng)基，將10%的樟芝菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，調(diào)節(jié)PH為3-8，培養(yǎng)溫度為20-35°C，搖瓶轉(zhuǎn)速為80-280r/min，培養(yǎng)7_15天，即可得到樟芝液體種子； (2)發(fā)酵罐發(fā)酵:先將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.1~0.2公斤/平方厘米，滅菌時(shí)間為1-2小時(shí)；當(dāng)樟芝液體種子pH值降至2.5-4時(shí)，將搖瓶中的樟芝種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，調(diào)整pH為5-8，培養(yǎng)溫度25-35°C，通氣量0.5-1.lvvm,攪拌轉(zhuǎn)速100-250r/min，培養(yǎng)7_30天，即可獲得樟芝發(fā)酵全液。
4.如權(quán)利要求3所述的抗禽流感病毒的樟芝菌絲體發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征在于，所述液體種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是: 馬鈴薯淀粉 I~3%麥芽糖I~5% 蛋白胨0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5% 硫酸鎂0.1~0.3%磷酸二氫鉀 0.05~0.1%。
5.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征是，所述樟芝菌株名為樟芝(Antrodia camphorata)。
6.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述醇溶液為甲醇或乙醇水溶液，濃度為60-95%。
7.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征在于步驟(6)中所述收集物干燥使用真空干燥，真空度0.02-0.06Mpa，干燥時(shí)間12-36小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)提取的制備方法，其特征在于步驟(7)中所述收集物粉碎時(shí)采用200目的中藥粉碎機(jī)對收集物進(jìn)行粉碎過篩。
9.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)在制備抗禽流感病毒藥物中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液活性物質(zhì)在制備抗禽流感病毒藥物中的用途，其特征在于所述樟芝發(fā)`酵全液活性物質(zhì)在藥物中的含量為10%-20%。
【文檔編號】A61P31/16GK103816190SQ201310404668
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】宋愛榮, 趙晨, 孔超, 黃芳, 孫效樂 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)