一種樟芝多糠的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種樟芝多糖的提取方法。所述的提取方法包括以下步驟：先用接腫鏟取斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的帶培養(yǎng)基的樟芝菌裝入三角瓶中進行培養(yǎng)；再取培養(yǎng)后的樟芝菌10%-20%接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)并將培養(yǎng)液過篩，過濾，取濾液粉碎勻漿，水浴浸提，離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，醇析，離心，取沉淀加等量蒸餾水溶解，并加氯仿異戊醇劇烈振蕩，上清液加無水乙醇回流提取，離心分離乙醇，將沉淀冷凍干燥，制得樟芝菌多糖干品；將樟芝菌多糖粗品采用中空纖維超濾膜進行過濾，得到不同分子量的多糖體，分別經(jīng)濃縮干燥后得樟芝多糖的干制品。本發(fā)明對樣品先后培養(yǎng)、水浴浸提、離心濃縮及回流提取，多糖產(chǎn)量高，提取充分，多糖破壞少，能耗低，無污染。
【專利說明】一種樟芝多糠的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種樟芝多糖的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]樟芝(Antrodia)又名牛樟芝、是臺灣特有的珍貴藥用多孔真菌，據(jù)報道。研究顯不，樟芝含有多種生物活性物質(zhì)，如樟芝多糖、三職類、S0D、腺苷、免疫球蛋白，維生素,微量元素、核酸、凝血素、氨基酸、固醇類、木質(zhì)素和血壓穩(wěn)定物質(zhì)等，具多有多種生理活性，如保肝、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫、抗病原菌及解毒等。在臺灣地區(qū)，樟芝被廣泛用于調(diào)血脂、解毒保肝、排毒，至今未有不良反應(yīng)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，樟芝多糖是樟芝中主要的保健功能因子之一，其具有提高免疫、抗癌、防止動脈粥樣硬化及降低心腦血管事件發(fā)生等功效。目前，樟芝多糖已引起了國內(nèi)學(xué)者的廣泛關(guān)注。
[0003]近年來研究發(fā)現(xiàn)，樟芝多糖的生理活性與其分子量、分子結(jié)構(gòu)及提取工藝等均密切相關(guān)，分離提取工藝可對樟芝多糖的藥用價值具有真接的影響，目前樟芝多糖多采用熱水提取、醇析等工藝，不僅操作復(fù)雜，而且不易獲得多糖粗品，且得糖率低，給其工業(yè)化應(yīng)用帶來困難。為此，本發(fā)明提供一種操作簡便、得糖率高、適于工業(yè)化生產(chǎn)的樟芝多糖的提取方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷提供一種操作簡便、得糖率高、適于工業(yè)化生產(chǎn)的樟芝多糖的提取方法
本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種樟芝多糖的提取方法，包括以下步驟:
(1)樟芝菌種子液的培養(yǎng):用接腫鏟取l-3cm2的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的帶培養(yǎng)基的樟芝菌裝入500ml的三角瓶中進行培養(yǎng)；
(2)取步驟(I)中培養(yǎng)后的樟芝菌10%-20%接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，將培養(yǎng)液過40目篩，截留的菌絲體再用3倍蒸餾水洗滌過濾，篩下即為樟芝發(fā)酵液；
(3)樟芝菌多糖的提取:將步驟(2)中制得的樟芝發(fā)酵液過濾濾除菌體，取濾液加2-3倍量蒸餾水于多功能機粉碎勻漿，水浴浸提，離心，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，取濃縮液在4°C條件下進行醇析，離心，取沉淀加等量蒸餾水溶解后，加2-3倍氯仿異戊醇劇烈振蕩，上清液加4-5倍量無水乙醇回流提取3-5次，每次1.5-2h，離心分離乙醇，將沉淀冷凍干燥，制得棒之囷多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品處理:將步驟(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纖維超濾膜進行過濾，得到不同分子量的多糖體，分別經(jīng)濃縮干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0005]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的三角瓶中的裝液量為100_150ml。
[0006]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的培養(yǎng)溫度為25_28°C，培養(yǎng)時間為3_5d。
[0007]優(yōu)選的，步驟(2)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度25_28°C，轉(zhuǎn)速200_230r/min,培養(yǎng)時間6-8d，通氣量120-150L/h，裝液量:5_7L。
[0008]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的水浴浸提時水料比為(1-3):1 ;水浴浸提的的時間為1.5-2h，溫度為120-135°C ；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的操作溫度為60_65°C。
優(yōu)選的，步驟(3)中所述的醇析過程中采用的溶劑為無水乙醇。
[0009]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的醇析過程中，所述的濃縮液與溶劑的體積比為(1-1.5):(4-5)。
[0010]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的氯仿異戊醇中，氯仿與異戊醇的體積比為(4-6):(0.8-1.5)。
[0011]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的離心時間為30-60min，離心溫度為25_28°C。
[0012]優(yōu)選的，步驟(4)中所述的超濾過程中壓力為0.2-0.5Mpa，所述的中空纖維超濾膜為1000、100、1kDa的三組件中空纖維超濾膜。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
1.本發(fā)明先后采用水浴浸提、離心濃縮及無水乙醇回流提取，可對樟芝中多糖進行充分提?。磺以谒〗釙r，本發(fā)明將水料比控制為(1_3):1，不僅保證了多糖的充分提取，避免了水提液總量增加導(dǎo)致醇沉?xí)r多糖的損失，而且也明顯降低了后續(xù)操作中的能耗。
[0014]2.目前多糖的含量測定多采用HPLC法，本發(fā)明中，在多糖的提取前，采用氯仿異戊醇劇烈振蕩，可有效去除蛋白沉淀，避免了樣品中蛋白質(zhì)對多糖出峰的影響，保證了 HPLC法測定含量的準確性與靈敏性。
[0015]3.超濾膜具有的微孔不對稱性結(jié)構(gòu)，使得大分子微粒流經(jīng)膜表面，小分子物質(zhì)流過超濾膜，從而保證大分子及小分子的有效分離，而且可常溫操作，耗能低，還具有可連續(xù)使用及無污染等優(yōu)點，可滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的需求。
[0016]4.多糖易溶于熱水，難溶于有機溶劑，本發(fā)明中，先對樣品采用乙醇預(yù)處理，可有效去除三萜類等脂溶性物質(zhì)用大部分色素，同時，還能有效軟化和破壞細胞膜，利于多糖的充分提取。
[0017]5.本發(fā)明中先取l_3cm2的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的帶培養(yǎng)基的樟芝菌裝入500ml的三角瓶中進行培養(yǎng)；在進行發(fā)酵培養(yǎng)時，接種量為10%_20%，可保證樟芝菌的生長繁殖更有利的進行，從而明顯提高其多糖含量。

【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明通過以下具體實施例更詳細的說明本發(fā)明，可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0019]實施例1
一種樟芝多糖的提取方法，包括以下步驟:
(1)樟芝菌種子液的培養(yǎng):用接腫鏟取Icm2的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的帶培養(yǎng)基的樟芝菌裝入裝液量為10ml的500ml的三角瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時間為3d ；
(2)取步驟(I)中培養(yǎng)后的樟芝菌10%接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時間6d，通氣量120_150L/h，裝液量:5L ;將培養(yǎng)液過40目篩，截留的菌絲體再用3倍蒸餾水洗滌過濾，篩下即為樟芝發(fā)酵液；
(3)樟芝菌多糖的提取:將步驟(2)中制得的樟芝發(fā)酵液過濾濾除菌體，取濾液加2-3倍量蒸餾水于多功能機粉碎勻漿，水浴浸提，水浴浸提時水料比為1:1;水浴浸提的的時間為1.5h，溫度為120°C ;離心，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，取濃縮液在4°C條件下進行醇析，離心，取沉淀加等量蒸餾水溶解后，加2倍氯仿異戊醇劇烈振蕩，上清液加4倍量無水乙醇回流提取3次，每次1.5h，離心分離乙醇，將沉淀冷凍干燥，制得樟芝菌多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品處理:將步驟(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纖維超濾膜進行過濾，得到不同分子量的多糖體，分別經(jīng)濃縮干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0020]步驟(3)中所述的醇析過程中采用的溶劑為無水乙醇。
[0021]步驟(3)中所述的醇析過程中，所述的濃縮液與溶劑的體積比為1: 4。
[0022]步驟(3)中所述的氯仿異戊醇中，氯仿與異戊醇的體積比為4: 0.8。
[0023]步驟(3)中所述的離心時間為30min，離心溫度為25°C。
[0024]步驟(4)中所述的超濾過程中壓力為0.2Mpa，所述的中空纖維超濾膜為1000、10UOkDa的三組件中空纖維超濾膜。
[0025]實施例2
一種樟芝多糖的提取方法，包括以下步驟:
(1)樟芝菌種子液的培養(yǎng):用接腫鏟取3cm2的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的帶培養(yǎng)基的樟芝菌裝入裝液量為150ml的500ml的三角瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間為5d ；
(2)取步驟(I)中培養(yǎng)后的樟芝菌20%接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，轉(zhuǎn)速230r/min，培養(yǎng)時間6_8d，通氣量150L/h，裝液量:7L ;將培養(yǎng)液過40目篩，截留的菌絲體再用3倍蒸餾水洗滌過濾，篩下即為樟芝發(fā)酵液；
(3)樟芝菌多糖的提取:將步驟(2)中制得的樟芝發(fā)酵液過濾濾除菌體，取濾液加3倍量蒸餾水于多功能機粉碎勻漿，水浴浸提，水浴浸提時水料比為3:1 ;水浴浸提的的時間為2h，溫度為135°C ;離心，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，取濃縮液在4°C條件下進行醇析，離心,取沉淀加等量蒸餾水溶解后,加3倍氯仿異戊醇劇烈振蕩，上清液加5倍量無水乙醇回流提取5次，每次2h，離心分離乙醇，將沉淀冷凍干燥，制得樟芝菌多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品處理:將步驟(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纖維超濾膜進行過濾，得到不同分子量的多糖體，分別經(jīng)濃縮干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0026]步驟(3)中所述的醇析過程中采用的溶劑為無水乙醇。
[0027]步驟(3)中所述的醇析過程中，所述的濃縮液與溶劑的體積比為1.5:5。
[0028]步驟(3)中所述的氯仿異戊醇中，氯仿與異戊醇的體積比為6: 1.5。
[0029]步驟(3)中所述的離心時間為60min，離心溫度為28°C。
[0030]步驟(4)中所述的超濾過程中壓力為0.5Mpa，所述的中空纖維超濾膜為1000、10UOkDa的三組件中空纖維超濾膜。
[0031]實施例3
一種樟芝多糖的提取方法，包括以下步驟:
(1)樟芝菌種子液的培養(yǎng):用接腫鏟取2cm2的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的帶培養(yǎng)基的樟芝菌裝入裝液量為120ml的500ml的三角瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26°C，培養(yǎng)時間為4d ；
(2)取步驟(I)中培養(yǎng)后的樟芝菌15%接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)溫度6°C,轉(zhuǎn)速210r/min，培養(yǎng)時間7d，通氣量130L/h，裝液量:6L ;將培養(yǎng)液過40目篩，截留的菌絲體再用3倍蒸餾水洗滌過濾，篩下即為樟芝發(fā)酵液； (3)樟芝菌多糖的提取:將步驟(2)中制得的樟芝發(fā)酵液過濾濾除菌體，取濾液加3倍量蒸餾水于多功能機粉碎勻漿，水浴浸提，水浴浸提時水料比為2:1 ;水浴浸提的的時間為
1.8h，溫度為125°C;離心，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，取濃縮液在4°C條件下進行醇析，離心,取沉淀加等量蒸餾水溶解后,加2倍氯仿異戊醇劇烈振蕩，上清液加5倍量無水乙醇回流提取4次，每次1.Sh,離心分離乙醇，將沉淀冷凍干燥，制得樟芝菌多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品處理:將步驟(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纖維超濾膜進行過濾，得到不同分子量的多糖體，分別經(jīng)濃縮干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0032]步驟(3)中所述的醇析過程中采用的溶劑為無水乙醇。
[0033]步驟(3)中所述的醇析過程中，所述的濃縮液與溶劑的體積比為1.2:4.5。
[0034]步驟(3)中所述的氯仿異戊醇中，氯仿與異戊醇的體積比為5:1.2。
[0035]步驟(3)中所述的離心時間為30_60min，離心溫度為26°C。
[0036]步驟(4)中所述的超濾過程中壓力為0.3Mpa，所述的中空纖維超濾膜為1000、10UOkDa的三組件中空纖維超濾膜。
[0037]以上所述實施例只是本發(fā)明的較佳實例，并非來限制本發(fā)明實施范圍，故凡依本發(fā)明申請專利范圍所述的構(gòu)造、特征及原理所做的等效變化或修飾，均應(yīng)包括本發(fā)明專利申請范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)樟芝菌種子液的培養(yǎng):用接腫鏟取l-3cm2的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的帶培養(yǎng)基的樟芝菌裝入500ml的三角瓶中進行培養(yǎng)； (2)取步驟(I)中培養(yǎng)后的樟芝菌10%-20%接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，將培養(yǎng)液過40目篩，截留的菌絲體再用3倍蒸餾水洗滌過濾，篩下即為樟芝發(fā)酵液； (3)樟芝菌多糖的提取:將步驟(2)中制得的樟芝發(fā)酵液過濾濾除菌體，取濾液加2-3倍量蒸餾水于多功能機粉碎勻漿，水浴浸提，離心，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，取濃縮液在4°C條件下進行醇析，離心，取沉淀加等量蒸餾水溶解后，加2-3倍氯仿異戊醇劇烈振蕩，上清液加4-5倍量無水乙醇回流提取3-5次，每次1.5-2h，離心分離乙醇，將沉淀冷凍干燥，制得棒之囷多糖干品； (4)樟芝多糖粗品處理:將步驟(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纖維超濾膜進行過濾，得到不同分子量的多糖體，分別經(jīng)濃縮干燥后得樟芝多糖的干制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(I)中所述的三角瓶中的裝液量為100-150ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(I)中所述的培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時間為3-5d。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度25-28°C，轉(zhuǎn)速200-230r/min，培養(yǎng)時間6_8d，通氣量120-150L/h,裝液量:5-7L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的水浴浸提時水料比為(1-3):1 ;水浴浸提的的時間為1.5-2h，溫度為120-135°C;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的操作溫度為60-65°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的醇析過程中采用的溶劑為無水乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的醇析過程中，所述的濃縮液與溶劑的體積比為(1-1.5):(4-5)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的氯仿異戊醇中，氯仿與異戊醇的體積比為(4-6):(0.8-1.5)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的離心時間為30-60min,離心溫度為25_28°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步驟(4)中所述的超濾過程中壓力為0.2-0.5Mpa，所述的中空纖維超濾膜為1000、100、1kDa的三組件中空纖維超濾膜。
【文檔編號】C08B37/00GK104278064SQ201410555913
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】劉巴寧, 鄭安喬 申請人:中山安蕎生物科技有限公司