專利名稱:一種大量生產γ-聚谷氨酸的方法
技術領域：
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本發(fā)明屬于高分子材料制備領域，本發(fā)明涉及一種生產Y-聚谷氨酸的方法。
背景技術:
y -聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過α -氨基和、-羧基間的酰胺鍵結合而成的一種多功能生物可降解高分子材料。由于Y-聚谷氨酸及其衍生物具有優(yōu)良的水溶性和吸附性，能徹底被生物降解，對人和動物安全無毒，可以食用等優(yōu)點，因而可作為保水劑、增稠劑、絮凝劑、重金屬吸附劑、藥物/肥料緩釋劑及藥物載體等，在農業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保、合成纖維和涂膜等領域具有廣闊的應用前景。隨著化工合成材料造成的環(huán)境污染日益嚴重，開發(fā)生物可降解材料在一定程度上替代化學材料已成為整個國際社會的迫切需求。
聚谷氨酸的制備方法有化學合成、提取和微生物發(fā)酵三種方法。微生物發(fā)酵法比前兩種方法的生產成本低，生產過程對環(huán)境的污染小，所以現(xiàn)在主要采用微生物發(fā)酵法生產Y-聚谷氨酸。國內外對Y-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝進行了廣泛的研究，主要以液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)工藝為主。南京工業(yè)大學篩選得一株Y-聚谷氨酸高產菌株Bcillius subtilis NX-2,并對液體發(fā)酵生產Y -聚谷氨酸做了比較全面的研究,并申請了專利，專利公開號為CN1346891。華中農業(yè)大學也進行了 Y _聚谷氨酸產生菌的篩選和工藝開發(fā)的工作，其菌種和液體生產工藝也已經申請了專利，專利公開號為CN1536071。韓國研究人員在2.5升發(fā)酵罐中對Bacillus licheniformis ATCC9945a采用流加高密度培養(yǎng)的方法,發(fā)酵 35 小時后可達到 35g/L 的終產量(Yoon SH, DO JH, Lee SY.Biotechnol.Lett,2000,22:585-588)。Kubota 在 Osaka City University 土壤中分離得到的一株 Bacillussubtilis F201，該菌株在最佳發(fā)酵生產條件下可達到50g/L的最高產量，這是文獻報道的最高產量(Kubota H.Biosci Biotec Biochem, 1993:1212-1213)。
雖然Y-聚谷氨酸的發(fā)酵生產取得了較大的進展，但是仍然存在生產周期較長，生產效率低下，生產成本較高的問題。因此，高效、低成本生產Y-聚谷氨酸仍有待進一步研究。

發(fā)明內容
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本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種大量生產高濃度Y-聚谷氨酸的方法
本發(fā)明的技術方案概述如下:
—種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，包括菌種的活化、種子液的制備和發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基中糖濃度降至5-20g/L時，以0.1-2.0ml/min的速度補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前2-6小時；流加培養(yǎng)基中各物質濃度分別為:葡萄糖600-1000g/L，硝酸銨30_60g/L, CaCl2.6H20 5_20g/L, FeCl3.6H20 0.05-0.15g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下(g/L):葡萄糖60-100，谷氨酸鈉60-100，酵母膏10-30，硝酸銨 3.0-6.0, NaCl 5.0-15, MgSO4.6H20 0.1-1.5，CaCl2.6H20 0.5-2.0, FeCl3.6H200.005-0.015，ρΗ6.0-8.0。
所述流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖600-900，硝酸銨30.0-60.0, CaCl2.6Η20
5.0-20.0, FeCl3.6Η20 0.05-0.15 ；
流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖800，硝酸銨41，CaCl2.6H20 10，F(xiàn)eCl3.6Η200.1，；
流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖700，硝酸銨30，CaCl2.6H20 5，F(xiàn)eCl3.6Η200.05 ；
流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖900，硝酸銨60，CaCl2.6H20 20，F(xiàn)eCl3.6Η200.15 ；
流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖1000，硝酸銨45，CaCl2.6Η20 15，F(xiàn)eCl3.6Η20
0.1 ；
流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖600，硝酸銨41，CaCl2.6H20 10，F(xiàn)eCl3.6Η200.I ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基中糖濃度降至7_15g/L時，補加流加培養(yǎng)基；
發(fā)酵條件:30L發(fā)酵罐裝液量為15L，按上述發(fā)酵培養(yǎng)基所示的配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為5.0% -15.0%，發(fā)酵溫度30-40°C，發(fā)酵時間24-72小時，通風量
1.0-2.0vvm,轉速200-600rpm ;發(fā)酵過程中當殘?zhí)墙抵?_20g/L時補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前6小時，流加速度為0 .1-2.0ml/min ；
有益效果:
(I)本發(fā)明使用的地衣芽孢桿菌微生物菌株可以高效的發(fā)酵生產Y-聚谷氨酸；
(2)通過對地衣芽孢桿菌菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化，特別是在發(fā)酵過程中補加葡萄糖、硝酸銨、CaCl2.6H20及FeCl3.6H20,使發(fā)酵液中的Y -聚谷氨酸的含量高達40_50g/L，并且使Y -聚谷氨酸的產率達到1.0-1.2g/L *h,從而提供一種高效廉價制備Y -聚谷氨酸的方法。
具體實施方式
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下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明中聚谷氨酸的生產方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求
書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本實用新型的保護范圍。
實施例1對照試驗
1.菌種的活化:在富含營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基斜面上于37°C培養(yǎng)16小時,制備成熟的斜面種子，固體培養(yǎng)基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L，瓊脂20g/L，ρΗ7.2 ；
2.種子液的制備:
將一環(huán)上述種子轉入含富含營養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C，220rpm培養(yǎng)16小時至對數(shù)生長期；
按照每升培養(yǎng)基的加入量配制種子培養(yǎng)基:葡萄糖30 ;酵母膏7 ;胰蛋白胨10 ；K2HPO40.5 ；MgS04.6H20 0.5，滅菌前ρΗ7.2 ；500ml的三角瓶中分裝50ml的培養(yǎng)基；
3.發(fā)酵罐發(fā)酵:
發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉80，酵母膏20，硝酸銨 4.1，NaCl 10，MgSO4.6H20 0.5，CaCl2.6H20 1.0, FeCl3.6H20 0.01，ρΗ7.0 ；
發(fā)酵條件:30L發(fā)酵罐裝液量為15L，按上述發(fā)酵培養(yǎng)基所示的配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間48小時，通風量1.5VVm，轉速400rpm ;發(fā)酵結束后經檢測Y -聚谷氨酸的產量為22.5g/L，Y -聚谷氨酸的產率為0.47g/
I.h ；
實施例2
菌種的活化和種子液的制備基本同實施例1 ;
3.發(fā)酵罐發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉80，酵母膏20，硝酸銨 4.1，NaCl 10，MgSO4.6H20 0.5，CaCl2.6H20 1.0, FeCl3.6H20 0.01，ρΗ7.0 ；
流加培養(yǎng)基:流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖800，硝酸銨41，CaCl2.6H2010，F(xiàn)eCl3.6H20 0.1 ；
發(fā)酵條件:30L發(fā)酵罐裝液量為15L，按上述發(fā)酵培養(yǎng)基所示的配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間36小時，通風量1.5VVm，轉速400rpm ;發(fā)酵過程中當殘?zhí)墙抵?0g/L時補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前6小時,流加速度為0.lml/min ;發(fā)酵結束后經檢測Y -聚谷氨酸的產量為22.0g/L, Y -聚谷氨酸的產率為0.6 Ig/1.h ；
實施例3
菌種的活化和種子液的制備基本同實施例1 ;
3.發(fā)酵罐發(fā)酵:
發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉80，酵母膏20，硝酸銨 4.1，NaCl 10，MgSO4.6H20 0.5，CaCl2.6H20 1.0, FeCl3.6H20 0.01，ρΗ7.0 ；
流加培養(yǎng)基:流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖700，硝酸銨30，CaCl2.6H205，F(xiàn)eCl3.6H20 0.05 ；
發(fā)酵條件:30L發(fā)酵罐裝液量為15L，按上述發(fā)酵培養(yǎng)基所示的配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間36小時，通風量1.5VVm，轉速400rpm ;發(fā)酵過程中當殘?zhí)墙抵?0g/L時補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前2小時，流加速度為0.5ml/min ;發(fā)酵結束后經檢測Y -聚谷氨酸的產量為30g/L，Y -聚谷氨酸的產率為
0.83g/l.h ；
實施例4
菌種的活化和種子液的制備基本同實施例1 ;
3.發(fā)酵罐發(fā)酵:
發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉 80，酵母膏 20，硝酸銨 4.1，NaCl 10，MgSO4.6H20 0.5，CaCl2.6Η201.0, FeCl3.6Η200.01，ρΗ7.0 ；
流加培養(yǎng)基:流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖900，硝酸銨60，CaCl2.6H2020，F(xiàn)eCl3.6H20 0.15 ；
發(fā)酵條件:30L發(fā)酵罐裝液量為15L，同實施例1配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間36小時，通風量1.5vvm,轉速400rpm ;發(fā)酵過程中當殘?zhí)墙抵?g/L時補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前4小時，流加速度為lml/min ;發(fā)酵結束后經檢測Y -聚谷氨酸的產量為42.5g/L，Y -聚谷氨酸的產率為1.18g/l.h ；
實施例5
菌種的活化和種子液的制備基本同實施例1 ;
3.發(fā)酵罐發(fā)酵:
發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉80，酵母膏20，硝酸銨 4.1，NaCl 10，MgSO4.6H20 0.5，CaCl2.6H20 1.0, FeCl3.6H20 0.01，ρΗ7.0 ；
流加培養(yǎng)基:流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖1000，硝酸銨45，CaCl2.6Η2015，F(xiàn)eCl3.6Η20 0.1 ；
發(fā)酵條件:30L發(fā)酵罐裝液量為15L，同實施例1配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間36小時，通風量1.5vvm,轉速400rpm ;發(fā)酵過程中殘?zhí)墙抵?g/L時補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前6小時，流加速度為1.5ml/min ;發(fā)酵結束后經檢測Y -聚谷氨酸的產量為34.5g/L，Y -聚谷氨酸的產率為0.96g/l.h ；
實施例6
菌種的活化和種子液的制備基本同實施例1 ;3.發(fā)酵罐發(fā)酵:
發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉80，酵母膏20，硝酸銨 4.1，NaCl 10，MgSO4.6H20 0.5，CaCl2.6H20 1.0, FeCl3.6H20 0.01，ρΗ7.0 ；
流加培養(yǎng)基:流加培養(yǎng)基的成分為(g/L):葡萄糖600，硝酸銨41，CaCl2.6H2010，F(xiàn)eCl3.6H20 0.1 ；
發(fā)酵條件:30L發(fā)酵罐裝液量為15L，同實施例1配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間36小時，通風量1.5vvm,轉速400rpm ;發(fā)酵過程中殘?zhí)墙抵?5g/L時補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前6小時，流加速度為2.0ml/min ;發(fā)酵結束后經檢測Y -聚谷氨酸的產量為18.7g/L，Y -聚谷氨酸的產率為0.52g/l.h ；
權利要求
1.一種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，通過對地衣芽孢桿菌菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化，特別是在發(fā)酵過程中補加流加培養(yǎng)基，可以有效提高Y-聚谷氨酸產量；所述方法包括如下步驟: (1)菌種的活化:在富含營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基斜面上于37°c培養(yǎng)16小時，制備成熟的斜面種子，固體培養(yǎng)基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L，瓊脂20g/L，ρΗ7.2 ； (2)種子液的制備: 將一環(huán)上述種子轉入富含營養(yǎng)的種子液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C，220rpm培養(yǎng)16小時至對數(shù)生長期； 按照每升培養(yǎng)基的加入量配制種子液體培養(yǎng)基:葡萄糖30 ;酵母膏7 ;胰蛋白胨10 ；K2HPO40.5 ；MgS04.6H200.5，滅菌前ρΗ7.2 ；500ml的三角瓶中分裝50ml的種子液體培養(yǎng)基； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵: 發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:葡萄糖60-100，谷氨酸鈉60-100，酵母膏10-30，硝酸銨3.0-6.0, NaC15.0-15, MgSO4.6Η200.1-1.5，CaCl2.6Η200.5-2.0, FeCl3.6Η200.005-0.015，ρΗ6.0-8.0,以上成分單位均為g/L ； 發(fā)酵條件:3 0L發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基量為15L，按上述發(fā)酵培養(yǎng)基所示的配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間48小時，通風量1.5vvm,轉速400rpm ； 補加流加培養(yǎng)基:當發(fā)酵培養(yǎng)基中糖濃度降至5-20g/L時，以0.1-2.0ml/min的速度補加流加培養(yǎng)基至發(fā)酵結束前2-6小時；流加培養(yǎng)基中各物質濃度分別為:葡萄糖600-1000g/L，硝酸銨 30-60g/L, CaCl2.6H205_20g/L，F(xiàn)eCl3.6H200.05-0.15g/L。
2.按權利要求
1所述一種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述步驟(3)中流加培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖600-900，硝酸銨30.0-60.0, CaCl2.6H205.0-20.0，F(xiàn)eCl3.6Η200.05-0.15，以上成分單位均為g/L。
3.按權利要求
1所述一種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述步驟(3)中流加培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖800，硝酸銨41，CaCl2.6H2010, FeCl3.6H200.1，以上成分單位均為g/L。
4.按權利要求
1所述一種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述步驟(3)中流加培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖700，硝酸銨30，CaCl2.6H205, FeCl3.6H200.05，以上成分單位均為g/L。
5.按權利要求
1所述一種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述步驟(3)中流加培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖900，硝酸銨60，CaCl2.6H2020, FeCl3.6H200.15，以上成分單位均為g/L。
6.按權利要求
1所述一種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述步驟(3)中流加培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖1000，硝酸銨45，CaCl2.6H2015, FeCl3.6H200.1，以上成分單位均為g/L。
7.按權利要求
1所述一種大量生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述步驟(3)中流加培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖600，硝酸銨41，CaCl2.6H2010, FeCl3.6H200.1，以上成分單位均為g/L。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種γ-聚谷氨酸的生產方法，特別是涉及一種大量生產高濃度的γ-聚谷氨酸的方法。本發(fā)明的技術方案概述如下1.菌種的活化；2.種子液的制備；3.發(fā)酵罐發(fā)酵；其特征在于通過在發(fā)酵過程中補加由葡萄糖、硝酸銨、CaCl2·6H2O和FeCl3·6H2O組成的流加培養(yǎng)基，使發(fā)酵產率達到1.18g/l·h，從而達到高效制備大量γ-聚谷氨酸的目的。
文檔編號C12R1/10GKCN102268465 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201110216717
公開日2013年5月8日 申請日期2011年7月29日
發(fā)明者喬長昇, 蘭玲芳, 李雪, 張帥 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (6), 非專利引用 (1),