γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌及生產(chǎn)γ-聚谷氨酸有機肥的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌，具體涉及一種γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌和一種 纖維素降解菌及利用該菌株混合發(fā)酵生產(chǎn)保水保肥有機肥的方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是農(nóng)業(yè)大國，又是水資源缺乏的國家，干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的一半 以上，干旱是限制我國農(nóng)業(yè)增收的重要因子，由此造成的損失位于各種自然災(zāi)害之首。為保 證我國農(nóng)業(yè)豐收，需要進行適當(dāng)?shù)毓喔?，但是我國水資源嚴重不足，而且分布不均，南多北 少，夏多冬少。目前多采用漫灌的方式，浪費嚴重；灌溉之后，大部分水及肥料蒸發(fā)或流失， 不能起到預(yù)期的作用；同時大量肥料流失必然導(dǎo)致施肥過量問題，既加劇了農(nóng)業(yè)面源污染， 又浪費了大量資源；過度施肥還導(dǎo)致了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，土壤有機質(zhì)下降，團粒結(jié)構(gòu) 性能降低，土壤板結(jié)現(xiàn)象加劇，保肥保水能力降低，大量微生物死亡，土壤微生物群落結(jié)構(gòu) 發(fā)生變化，許多有益微生物從優(yōu)勢種群變?yōu)榇我N群，作物易發(fā)生各類病害，同時肥料的利 用率較低，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，生產(chǎn)成本增加。
[0003] 多年來，為了提高肥料和水分的利用效率，人們對肥料和水分的增效因子進行了 大量的研究。其中具有水溶性高、吸附性強、生物相容性好，無毒、無害、無殘留，能促進作 物養(yǎng)分吸收的保水保肥劑受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，已研制出上百種保水保肥劑。在土壤中 添加一定量的保水保肥劑，不僅可以改善土壤的保水性能，節(jié)約灌溉用水，同時保水保肥劑 與土壤混合可以改善土壤的團粒結(jié)構(gòu)，使土壤變得松軟透氣，并能與土壤中的氮、磷、鉀等 營養(yǎng)元素和各種微量元素結(jié)合，減少養(yǎng)分流失，減少化肥使用量，增強農(nóng)作物的抗病能力。 γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamicacid，γ-PGA)是由D-谷氨酸或L-谷氨酸通過α-氨基 和γ-羧基間的酰胺鍵結(jié)合而成的，是某些桿菌（Bacillus)合成的一種胞外水溶性的高分 子氨基酸聚合物。γ-PGA具有優(yōu)良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為天 然無公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，γ-聚谷氨酸既可以進一步增加作物 的產(chǎn)量，還可以對肥料和水分起到很好的緩釋作用，具有顯著的保水保肥、增產(chǎn)節(jié)肥效果。
[0004] 目前γ-PGA的制備主要是生物發(fā)酵法，即通過培養(yǎng)生產(chǎn)聚谷氨酸的菌種 得到產(chǎn)品。目前國內(nèi)外用于研究γ-聚谷氨酸生產(chǎn)的典型菌株主要是Bacillus licheniformisATCC9945a和BacillussubtilisIF03335 等，發(fā)酵生產(chǎn)工藝通常有液體發(fā) 酵和固體發(fā)酵兩種。目前，γ-聚谷氨酸發(fā)酵工藝以液體深層發(fā)酵為主，但是仍然存在生產(chǎn) 周期較長，生產(chǎn)效率低下，生產(chǎn)成本較高的等問題。如李培培等（公開號CN104017760Α) 分離得到一株地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisDou-6,其底物谷氨酸轉(zhuǎn)化率僅為 60%。相比較于液體發(fā)酵而言，固體發(fā)酵擁有耗能低、設(shè)備簡易、成本低、產(chǎn)生廢棄物少、原 料來源廣泛等優(yōu)勢，故常用于有機肥、飼料、釀酒等微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。另一方面， 規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)生畜禽糞便以及農(nóng)業(yè)種植產(chǎn)生的秸桿等農(nóng)業(yè)廢棄物隨地棄置，不僅引起了嚴 重的面源污染，也極大浪費了大量的養(yǎng)分資源（C、N、P、K、S及微量元素）。目前，以農(nóng)業(yè) 廢棄物固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸有機肥的研究也有陸續(xù)報道，如CN102674986公開了 一種"具有保水保肥作用的生物有機肥及其制備方法"，該方法是利用單一芽孢桿菌菌株 以人畜糞便、生活垃圾或植物秸桿中進行γ-聚谷氨酸有機肥生產(chǎn)。CN101417894公開了 "一種含γ-聚谷氨酸的肥料添加劑的生產(chǎn)方法"，該方法用單一枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)PGA-7CCTCCΜ206102為發(fā)酵菌株，以氨基酸發(fā)酵廢液、豆柏、花生餅粉、麩皮、稻 草粉等為主要發(fā)酵基料進行固體發(fā)酵生產(chǎn)含γ-聚谷氨酸的肥料添加劑。
[0005] 綜上所述，γ-聚谷氨酸有機肥生產(chǎn)大都停留在以γ-聚谷氨酸單菌株發(fā)酵為主， 且γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率較低，因此亟需開發(fā)一種γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率高的新菌株和利用此 菌株高產(chǎn)生產(chǎn)γ-聚谷氨酸有機肥的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌（Bacillus sp.)J3CGMCCNo. 11582,該菌株能夠在谷氨酸底物濃度較低條件下單獨或與一株纖維素降 解菌混合發(fā)酵高產(chǎn)γ-PGA。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 從土壤樣品中篩選得到一株芽孢桿菌（Bacillussp. )J3,該菌株保藏于中國微生 物菌種保藏委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號為：CGMCCNo. 11582,保藏日期為： 2015年11月5日。該菌性狀特征如下：
[0009] (1)形態(tài)特征
[0010] 在蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上營養(yǎng)細胞為0. 6~1.OX1. 2~2. 5μπι大小的桿菌，37°C培養(yǎng)3~5天形成芽孢，芽孢大小0. 6~0. 9X1. 0~1. 5μm，為長圓形或圓柱形。
[0011] ⑵培養(yǎng)性質(zhì)
[0012] 牛肉膏、葡萄糖、瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)：30~40°C培養(yǎng)1天可大量生長，菌落表面 凸起，光滑無褶皺，菌落透明，邊緣呈規(guī)則圓形，菌落粘性大，挑起有絲狀。
[0013] -株纖維素降解菌--高溫單孢菌屬（Thermomonosporasp. )GC，從猜桿堆肥樣 品中分離篩選得到，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏單位 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏編 號為：CGMCCNo. 1364,保藏日期為：2005年4月28日。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法以及利用農(nóng)業(yè)廢棄物 進行固態(tài)混合發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸保水保肥有機肥的方法，即以農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)，利 用γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌和纖維素降解菌混合發(fā)酵生產(chǎn)保水保肥有機肥的方法，利用該有機 肥可提高土壤對水分和肥料的吸附性能，提升土壤持水能力及水肥利用率，減少施肥量和 灌溉量，減輕農(nóng)業(yè)面源污染，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，以達到農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。制備方法如 下：
[0015] (1)所用菌株為芽孢桿菌J3和高溫單孢菌GC，高溫單孢菌GC從中國微生物菌種 保藏委員會普通微生物中心購買獲得；
[0016] ⑵培養(yǎng)基
[0017] 1)活化培養(yǎng)基
[0018] 芽孢桿菌J3活化培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，瓊脂 18 ~20g，補水至 1000mL，pH7· 0 ~7· 4;
[0019] 高溫單孢菌GC活化培養(yǎng)基（高氏一號培養(yǎng)基）：可溶性淀粉20g、酵母粉2g、葡萄 糖 5g、KN03lg、Κ2ΗΡ040· 5g、MgS04 · 7H20 0· 5g、NaCl0· 5g、FeS04 · 7H20 0·Olg、瓊脂 18 ~ 2〇g、補水至l〇〇〇mL，ρΗ7· 2 ~7· 6 ;
[0020] 將芽孢桿菌J3和高溫單孢菌GC分別接入滅菌（121°C，30min)處理的牛肉膏蛋白 胨和高氏一號斜面培養(yǎng)基中活化備用；
[0021] 2)液體培養(yǎng)
[0022] 將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和高氏一號液體培養(yǎng)基高溫滅菌（121°C，30min)處 理后，將步驟1)活化好的芽孢桿菌J3和高溫單孢菌GC分別接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 和高氏一號液體培養(yǎng)基中，35°C、150r/min振蕩培養(yǎng)28h和50h;
[0023] 3)固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基：向農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵基質(zhì)中添加尿素或者調(diào)整基質(zhì)中秸 桿與糞便比例，使基質(zhì)中碳氮的摩爾比為15~35 :1;再按質(zhì)量比添加谷氨酸鈉0.5~ 2. 0%，葡萄糖或蔗糖1~3%，Κ2ΗΡ040· 1~1%，MgS04 · 7H20 0· 01~0· 1%，將谷氨酸鈉、 葡萄糖或蔗糖、K2HP04、MgS04 · 7H20混合溶于水中噴灑于上述基質(zhì)中，調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)含水率 為50~65%，pH值7. 0~8. 0,并攪拌均勻配成固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0024] (3)混合菌接種體積比
[0025] 芽孢桿菌J3 :高溫單孢菌GC= 1~3 :5~10;
[0026] (4)將步驟（3)得到的混合菌種子液按照固體培養(yǎng)基總質(zhì)量的0.1~2%的接 種量接入滅菌固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，30~37 °C通氣培養(yǎng)20~40d，停止發(fā)酵，即得含 γ-PGA保水保肥有機肥。
[0027] 本發(fā)明對液體培養(yǎng)基進行了改進，改進后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和高氏 一號液體培養(yǎng)基的配方分別為：改進后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方：牛肉膏5g、蛋 白胨10g、葡萄糖5g、NaCl5g，補水至1000mL，pH7. 0~7. 4;改進后的高氏一號液體 培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉15g、酵母粉2g、葡萄糖10g、KN03lg、KH2P040 . 5g、K2HP040 . 5g、 MgS04 · 7H200. 5g、NaCl0· 5g、FeS0