一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多糖產(chǎn)生菌株及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 熱凝膠多糖是一種由微生物產(chǎn)生的胞外多糖，由葡萄糖殘基通過(guò)β-1，3糖苷鍵 連接而成的葡聚糖，具有受熱形成凝膠的特性。熱凝膠多糖形成的膠不僅具有很強(qiáng)的熱穩(wěn) 定性，而且具有凍融穩(wěn)定性，能耐受多輪凍融處理仍保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可作為食品固型劑、 增稠劑、可食性膜等，也可作為功能性物質(zhì)改善食品的粘彈性和適口性等品質(zhì)。作為一種安 全的多糖，熱凝膠多糖已被美國(guó)食品和藥品管理局（FDA)批準(zhǔn)可用于食品添加劑，在食品 工業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。熱凝膠多糖還具有重要的藥理性能，磺酸化的熱凝膠多糖具有 抗HIV病毒的活性，在制藥工業(yè)具有巨大的市場(chǎng)潛力。
[0003]目前熱凝膠多糖工業(yè)化生產(chǎn)在日本已獲得成功，我國(guó)相關(guān)生產(chǎn)和研究尚處于起步 階段。近些年我國(guó)雖在熱凝膠多糖產(chǎn)生菌種和發(fā)酵工藝方面取得了一些進(jìn)展，提高了熱凝 膠多糖的產(chǎn)量，但所生產(chǎn)的熱凝膠多糖凝膠強(qiáng)度仍較低，產(chǎn)品性能差，在市場(chǎng)上缺乏競(jìng)爭(zhēng) 力。
[0004] 熱凝膠多糖產(chǎn)生菌種主要有土壤桿菌屬、根瘤菌屬和纖維單胞菌菌屬等屬的細(xì) 菌，產(chǎn)生菌種類(lèi)較少。菌種產(chǎn)熱凝膠多糖的量和多糖的凝膠強(qiáng)度間無(wú)相關(guān)性。有的菌種熱 凝膠多糖產(chǎn)量高，但凝膠性差，凝膠強(qiáng)度低；有的菌種產(chǎn)熱凝膠多糖凝膠強(qiáng)度高，但產(chǎn)量低。 目前的研究注重通過(guò)菌種選育和工藝優(yōu)化提高產(chǎn)量，而很少結(jié)合凝膠特性進(jìn)行選育菌種和 優(yōu)化工藝，使得產(chǎn)品的性能不能滿足應(yīng)用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株及其應(yīng)用，該菌株產(chǎn) 生的熱凝膠多糖分子量大、凝膠強(qiáng)度高、產(chǎn)量高，具有工業(yè)化應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株，所述菌株為根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6,保 藏編號(hào)為CGMCCNo. 11547,核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，包括：
[0008] 將根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH_6為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，得到發(fā) 酵液，然后分離提純，干燥，制得熱凝膠多糖；
[0009] 其中種子培養(yǎng)為：在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為28-30°C，搖床轉(zhuǎn)速180-200rpm， 培養(yǎng)時(shí)間16_20h;液體深層發(fā)酵為：在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，溫度為28°C-30°C，接種量 3%-10% (v/v),搖床轉(zhuǎn)速 200-240rpm，培養(yǎng)時(shí)間 3d-5d。
[0010] 所述種子培養(yǎng)基為：蔗糖 20g/L、（NH)2HP04 3g/L、KH2P04lg/L、MgS04· 7H20 0· 5g/ L、酵母提取物lg/L、CaC03 3g/L，pH= 6. 8-7. 2。
[0011] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：碳源 60g/L、（NH) 2HP04 2. 3g/L、KH2P04lg/L、MgS04. 7H20 0· 5g/L、有機(jī)氮源lg/L、CaC03 3g/L，pH= 6· 8-7. 2。
[0012] 所述碳源為葡萄糖或/和蔗糖。
[0013] 所述有機(jī)氮源為酵母提取物和/或玉米漿。
[0014] 所述分離提純具體為：取發(fā)酵液于4500-5000rpm離心3-5min，除去上清液，再加 水補(bǔ)充至原體積，然后按體積比1:1加入〇. 3-0. 6MNaOH溶液，攪拌均勻，靜止放置0. 5-lh， 然后于9000-12000rpm離心5-10min，取上清液，加入(λ3MHC1調(diào)至最終pH值為中性，再用 80目濾布進(jìn)行過(guò)濾，所得的固形物中再加入1-2倍體積的水，再過(guò)濾，最后將過(guò)濾得到的固 形物中加入2-3倍體積的95%乙醇，攪勻后于7000-9000rpm離心5-10min。
[0015] 所述干燥溫度為50-60 °C。
[0016] 所述熱凝膠多糖的分子量為2. 25X106-2. 50X106Da，純度為88-92% (w/w)。
[0017] 2% (w/v)熱凝膠多糖95°C加熱lOmin的凝膠強(qiáng)度是760-900g/cm2。
[0018] 本發(fā)明的熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株根瘤菌DH-6(Rhizobiumsp.DH-6)于2015年10月 28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11547,系從土壤中分離篩 選得到的。
[0019] 熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的篩選方法是從土壤中經(jīng)平板菌落初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，經(jīng) 測(cè)定熱凝膠多糖產(chǎn)量和凝膠強(qiáng)度而得到。
[0020] 篩選平板培養(yǎng)基（g/L) :10g葡萄糖，5g酵母提取物，0. 05g苯胺藍(lán)，20g瓊脂， pH7. 2. 30°C培養(yǎng) 2 ~3d。
[0021] 挑選篩選平板上藍(lán)色的菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)4d后，取發(fā)酵液 95°C加熱10分鐘，觀察能否形成凝膠。對(duì)能形成凝膠的發(fā)酵液提取其凝膠多糖。
[0022] 熱凝膠多糖產(chǎn)量的測(cè)定方法：取一定量發(fā)酵液于5000rpm離心5min，除去上清液， 再加水補(bǔ)充至原體積。然后按體積比1:1加入〇. 6MNaOH溶液，攪拌均勻，靜止放置1小時(shí)。 然后于9000rpm離心lOmin，取上清液，加入0. 3MHC1中和至pH= 7。然后用80目濾布進(jìn) 行過(guò)濾，所得固形物中再加入2倍體積的水，再過(guò)濾，最后將過(guò)濾得到的固形物中加入3倍 體積的95%乙醇，攪勻后于9000rpm離心10min，取沉淀放入烘箱中60°C干燥。
[0023] 凝膠強(qiáng)度測(cè)定方法：取0. 3g樣品于15mL水中，用高速攪拌機(jī)使樣品在水中分散均 勾，制成懸浮液，將懸浮液轉(zhuǎn)移至18_X180mm的試管中，在真空狀態(tài)下抽氣3min，然后將 試管放入95°C水中加熱10min，取出后在冷水中冷卻30min。從試管中取出凝膠，取離底部 20mm和30mm處的一段10mm的凝膠，用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定（探頭：P5,直徑0. 5cm不銹鋼活塞 式圓柱體。探頭移動(dòng)速度：250mm/min)。
[0024] 本發(fā)明的根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH_6,已于2015年10月28日保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNo. 11547。
[0025] 有益效果
[0026] 本發(fā)明提供了一株熱凝膠多糖產(chǎn)生菌，該菌株產(chǎn)生的熱凝膠多糖分子量大、凝膠 強(qiáng)度高、產(chǎn)量高，具有工業(yè)化應(yīng)用前景。采用本發(fā)明制備熱凝膠多糖的方法，熱凝膠多糖產(chǎn) 量達(dá)23.9 8/1，分子量為2.25\ 106-2.50\1060&，2%熱凝膠多糖95°(：加熱101^11的凝膠強(qiáng) 度為 760 ~900g/cm2。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1熱凝膠多糖的4NMR圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 菌株的篩選
[0031] (1)稱(chēng)取土樣10g，加入90mL無(wú)菌水，少量玻璃珠放入錐形瓶中，搖床振蕩lOmin， 制成土壤懸濁液。
[0032] (2)靜置lOmin后，取0.lmL加入到0. 9mL無(wú)菌生理鹽水中，經(jīng)系列梯度稀釋至 10 4、10 5、10 6三個(gè)梯度，分別取0.lmL涂篩選平板。
[0033] (3)將平板置于30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-3d后觀察。
[0034] (4)挑選菌落變藍(lán)且顏色較深的菌落，在平板上劃線，挑取單菌落保藏。將平板上 篩選得到的菌株進(jìn)一步接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，培養(yǎng)條件為30°C、240rpm、 4d〇
[0035] (5)取5ml發(fā)酵液于95°C水浴加熱lOmin，觀察能否形成凝膠。對(duì)能形成凝膠的發(fā) 酵液提取其凝膠多糖，測(cè)定熱凝膠含量和凝膠強(qiáng)度。最終得到一株產(chǎn)量高、凝膠強(qiáng)度大、性 能穩(wěn)定的菌株DH-6。
[0036] 篩選平板培養(yǎng)基（g/L) :10g葡萄糖，5g酵母提取物，0. 05g苯胺藍(lán)，20g瓊脂， pH7. 2.發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):蔗糖 60、（ΝΗ)2ΗΡ04 2. 3、ΚΗ2Ρ04 1、MgS04. 7H20 0. 5、酵母提取物 l、CaC03 3、pH= 7· 0。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] 分離菌株DH-6的鑒定
[0039] ⑴形態(tài)鑒定
[0040] 在LB平板培養(yǎng)Id后，菌落圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，菌落微微凸起，灰白色。 顯微鏡下菌體細(xì)桿狀，革蘭氏染色陰性。
[0041] ⑵生理生化鑒定
[0042] 菌株DH-6的生理生化特征見(jiàn)表1.
[0043] 表1 :菌株DH-6生理生化特征
[0044]
[0045] 其中，" + "表示呈陽(yáng)性反應(yīng)，""表示呈陰性反應(yīng)。
[0046] ⑶WSrDNA序列鑒定
[0047] 提取菌株DH-6的總基因組DNA，并以此為模板，擴(kuò)增該菌株的16SrDNA 序列，其引物序列為SEQIDNo. 1，F(xiàn):5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，SEQIDΝο·2， R:5' -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，SEQIDNo. 3。該菌種的 16SrDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中 比對(duì)結(jié)果顯示，該菌株與Rhizobiumsp.最為接近，該菌株為根瘤菌屬（Rhizobiumsp.)細(xì) 菌。
[0048] 結(jié)合該菌株的形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列，最終判定菌株DH-6應(yīng)屬于根 瘤菌屬的一種（Rhizobiumsp.)，命名為Rhizobiumsp.DH-6。此菌株于2015年10月28日 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，