專利名稱:一種新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白的高效表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白——7jC 蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的高效表達(dá)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明高效表達(dá)的對(duì)象是水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p_rPA)，該融合蛋白是通過一個(gè)(Gly)3柔性肽基團(tuán)將重組水蛭素ΠΙ的C末端12肽與rPA基因融合而成的一種同時(shí)具有抗凝溶栓雙功能的全新蛋白(吳梧桐，余蓉，等溶栓和抗凝雙功能融合蛋白、 制備方法及其應(yīng)，中國(guó)專利公開號(hào)CN1970574)。該蛋白通過目前最常用的表達(dá)系統(tǒng)一大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)(余蓉等抗凝、溶栓雙功能水蛭素12肽一瑞替普酶融合蛋白的模擬、構(gòu)建與表達(dá)，藥物生物技術(shù)2007，14 (3) :168-172)。
溶栓藥物瑞替普酶(ret印lase，r-PA)是人組織纖溶酶原激活劑(t_PA)的缺失變異體，它是在t-PA分子原結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，刪除了其中的kringle I,Finger,EGF 3個(gè)結(jié)構(gòu)域的單鏈非糖基化蛋白，分子量為39 kDa，含有9對(duì)二硫鍵，為第三代溶栓藥物。r-PA起效快，藥效強(qiáng)，出血等副作用小。水蛭素是迄今作用最強(qiáng)的特異性凝血酶抑制劑，具有很強(qiáng)的抗凝、抗栓活性，其抗血栓性能優(yōu)于肝素，對(duì)多種血栓疾病具有預(yù)防和治療效果。目前研究已確認(rèn)，水蛭素從10肽開始具有抗凝活性，以12肽為具有最大活性的最小肽段。水蛭素 12肽其較小的分子量相對(duì)于水蛭素全長(zhǎng)蛋白來(lái)說(shuō)更有利于減小抗原性的副作用和影響。
由這兩者融合而成的新型抗凝溶栓雙功能蛋白，具有更長(zhǎng)的作用半衰期，方便患者使用，且能有更高選擇性地作用于血栓部位、和全身出血性副作用小等特點(diǎn)，作用更為肯定可靠，而其較小的分子量更有利于減小抗原性的副作用和影響。它可以在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，但在本發(fā)明的優(yōu)化之前，該融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)水平很低，約占全菌總蛋白的12%。經(jīng)過本發(fā)明的優(yōu)化后，其表達(dá)量提高到約四％。本發(fā)明的關(guān)鍵是在培養(yǎng)基中添加了鈣、鎂兩種微量元素并且通過搖床轉(zhuǎn)速來(lái)控制通風(fēng)量。事實(shí)證明，這兩個(gè)因素對(duì)提高表達(dá)量具有顯著的影響。大腸桿菌表達(dá)體系高效、經(jīng)濟(jì)，可用高密度發(fā)酵工藝進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，因而降低了成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)的對(duì)象是一種全新的抗凝溶栓雙功能融合蛋白——瑞替普酶-水蛭素 12肽融合蛋白(HV12p-rPA)，在大腸桿菌中表達(dá)的該融合蛋白，其表達(dá)水平的高低直接影響后續(xù)的研究及其產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)展。本專利針對(duì)這些問題，公開了一種高效表達(dá)該融合蛋白的方法。
高效表達(dá)方法如下
以1%的接種量，將甘油(15%)管保存的菌種接種至新鮮含Am (lOOug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h，使菌種得到活化。再將此活化的菌液轉(zhuǎn)接至蒸餾水配制的LB培養(yǎng)基(含Amp濃度為100ug/ml)中，按照5%的接種量加入菌種，37 °C，200r/min恒溫培養(yǎng)3h后， 加入誘導(dǎo)劑IPTG使終濃度為lmmol/L，再以200r/min，39°C恒溫誘導(dǎo)4h，結(jié)束后，收菌，即 4°C下以8 000r/min離心3min，所得菌體沉淀以PBS (pH7. 4)吹勻洗滌一次后，同條件離心得菌體，可獲得高效表達(dá)的水蛭素12肽與r-PA融合蛋白，表達(dá)量約占總蛋白四％。
其中優(yōu)化方案如下
采用正交法，選取搖瓶培養(yǎng)條件中七個(gè)主要因素進(jìn)行兩水平正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。該七個(gè)因素為培養(yǎng)基的配制、接種量、誘導(dǎo)時(shí)間、轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)溫度、補(bǔ)料方式、微量元素。借助SDS-PAGE和Bandscan凝膠分析軟件，獲得該融合蛋白在菌體總蛋白中的表達(dá)量百分?jǐn)?shù)，作為考察條件優(yōu)化的目標(biāo)量。選用 、(27)安排，進(jìn)行八次實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，通過極差分析，顯示出微量元素鈣、鎂的
添加以及搖床轉(zhuǎn)速(即通風(fēng)量)對(duì)表達(dá)量結(jié)果影響最大。其他因素則是綜合發(fā)酵工藝的簡(jiǎn)便以及節(jié)約資源的角度來(lái)選取。
本發(fā)明是通過控制通風(fēng)量和添加微量元素來(lái)提高水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的表達(dá)水平，使其表達(dá)量提高到約四％。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)便、易行，提高產(chǎn)量， 但不提高成本。大大節(jié)省了時(shí)間、人力、物力和財(cái)力。無(wú)論對(duì)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模或商業(yè)化生產(chǎn)均有較好的應(yīng)用價(jià)值。


圖中 1 為中分子量 marker (6 —10 分別表示 97. 4KD、66. 2KD、42. 7KD、31. 0KD、 14. 4KD) ；2-4分別為三次平行實(shí)驗(yàn)包涵體表達(dá)量；11代表融合蛋白。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一
①保種取牛奶凍干管中的HrP/BL21表達(dá)工程菌，以LB液體培養(yǎng)基配成溶液后，在LB 固體培養(yǎng)基(含lOOug/mL Amp)平板上涂布，37°C培養(yǎng)過夜，挑取平板上菌落接種至LB液體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，37°C，200r/min振搖過夜。以15%的甘油保存于_20°C冰箱中備用。
②搖瓶發(fā)酵以1%的接種量，將甘油(15%)管保存的菌種接種至新鮮含Amp (lOOug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h，使菌種得到活化。再將此活化的菌液按5%的接種量轉(zhuǎn)接至搖瓶中，搖瓶?jī)?nèi)為蒸餾水配制的LB培養(yǎng)基，其中含AmplOOug/mLCi^ lmmol/
L、M g 20mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)3h后，加IPTG (lmmol/L)作為誘導(dǎo)劑，39°C下，200r/min誘導(dǎo) 4h。
③收菌誘導(dǎo)結(jié)束后，收菌，即4°C下以8 OOOr/min離心;3min，所得菌體沉淀以 PBS (pH7. 4)吹勻洗滌一次后，同條件離心得菌體。
④菌體的破碎以Tris-Cl CpH 8. 0)重懸菌體，250W，kX 10s，冰浴超聲累計(jì) 5min, 12 000r/min, 4°C離心 20min 得包涵體，_20°C保存。[0017]實(shí)施例二
吸取超聲裂解后的溶液(未離心)IOOul到EP管中，加入IOOul IXSDS的上樣緩沖液。 煮沸3-5分鐘后，每個(gè)電泳樣品各加20ul做SDS-PAGE，以考馬斯亮藍(lán)G-25染色6h，脫色后進(jìn)行掃描，再以bandscan 3. 0軟件計(jì)算目的蛋白在菌體總蛋白中的表達(dá)量。
采用該條件做三次平行試驗(yàn)，結(jié)果表達(dá)量分別為28. 3%,26. 5%,31. 1% 平均表達(dá)量為28. 6%，其SDS-PAGE結(jié)果如附圖。
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的方法，其特征在于 優(yōu)化表達(dá)該融合蛋白的大腸桿菌的培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基組成、接種量、誘導(dǎo)時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速即通風(fēng)量、誘導(dǎo)溫度和微量元素)，建立了一套使表達(dá)量提到高30%的培養(yǎng)條件，即在蒸餾水配制的LB培養(yǎng)基(含Amp濃度為100ug/ml)中，按照5%的接種量加入菌種，37°C，200r/min 恒溫培養(yǎng)汕后，加入誘導(dǎo)劑IPTG使終濃度為lmmol/L，再以200r/min，39°C恒溫誘導(dǎo)4h， 可獲得表達(dá)量約為四％的水蛭素12肽與r-PA融合蛋白。
2.按照權(quán)利要求
1所述新型雙功能HV12p-rPA融合蛋白高效表達(dá)方法，其特征在于 表達(dá)對(duì)象為全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，其表達(dá)形式為包涵體蛋白。
3.按照權(quán)利要求
1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表達(dá)方法，其特征在于 培養(yǎng)基組成為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，其中添加了微量元素Ca2+、Mg2+濃度分別為lmmol/L和20mmol/L。
4.按照權(quán)利要求
1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表達(dá)方法，其特征在于 接種量為5%，誘導(dǎo)時(shí)間為4h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，誘導(dǎo)溫度為39°C，誘導(dǎo)劑為IPTG，其濃度為 lmmol/L。
專利摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及到一種新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的高效表達(dá)。高效表達(dá)法通過優(yōu)化表達(dá)HV12p-rPA蛋白的大腸桿菌的7個(gè)培養(yǎng)條件，證明搖床轉(zhuǎn)速即通風(fēng)量和微量元素對(duì)表達(dá)量提高有顯著影響，使其提高到約29%。本方法簡(jiǎn)單、易行、高效，不提高成本，對(duì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；蛏虡I(yè)化生產(chǎn)均有較好應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/19GKCN102250992SQ201110141067
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月30日
發(fā)明者余蓉, 楊繼虞, 梁蘭 申請(qǐng)人:四川大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan