專利名稱:一種一體化檢測(cè)α、β突變型地中海貧血的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種一體化檢測(cè)α、β突變型地中海貧血的試劑盒，特別是涉及一種利用多重不對(duì)稱擴(kuò)增及反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)α、β地中海貧血突變型的試劑盒，該試劑盒包含一套特異性核苷酸多態(tài)性探針和擴(kuò)增樣品中靶基因的PCR引物，可同時(shí)檢測(cè)由于點(diǎn)突變引起的α、β地中海貧血，將廣泛應(yīng)用于地中海貧血的檢測(cè)及優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
地中海貧血分為α、β、δ、δβ、Υδβ等幾種類型，常見的為α地中海貧血 (簡(jiǎn)稱α地貧)和β地中海貧血(簡(jiǎn)稱β地貧)，是我國南方各省最常見、危害最大的遺傳病之一，也是世界上最常見的遺傳性疾病之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)全世界約有1. 5億多人攜帶地貧基因。在我國的廣東、廣西、海南、香港、湖南、湖北、云南、貴州、四川等地區(qū)常見，黃河以南至長江流域，臺(tái)灣、福建及西藏等省(區(qū))均有病例報(bào)道；患者以漢族多見，亦可見于回、傣、壯、苗和布衣等少數(shù)民族，海南黎族地貧基因突變的發(fā)生率達(dá)58.4%。抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西“地貧”基因攜帶者高達(dá)20%，居全國之首，廣東為12%，居第二位，四川、重慶等省市也是高發(fā)區(qū)，有報(bào)導(dǎo)發(fā)病率在4 7%。
α地貧是一種由于α-珠蛋白(a-Globin)基因突變導(dǎo)致α-珠蛋白合成減少， α-鏈/非 α-鏈比例失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳性溶血性血紅蛋白病。分缺失型和突變型 (非缺失型突變)兩類，突變型α-地貧是指用限制性內(nèi)切酶圖譜法未能檢測(cè)出明顯的基因缺失，但在其中可能包括導(dǎo)致基因功能喪失的小片段核苷酸的缺失，插入或堿基替代。非缺失型α-地貧的突變大多位于功能較強(qiáng)的α2珠蛋白基因，故非缺失型血紅蛋白H病患者的臨床表現(xiàn)要比缺失型血紅蛋白H病患者的臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重。目前世界上已報(bào)道了至少46種引起非缺失型α -地貧的點(diǎn)突變，這些突變影響mRNA加工，mRNA的翻譯及翻譯后肽鏈不穩(wěn)定或肽鏈縮短，導(dǎo)致α-珠蛋白鏈合成減少從而引起α地中海貧血。中國人群中目前已報(bào)道了 α aCD30、α α 31、α α 59、α α cs、α α QS、α α麗6種α地貧突變類型。我國最常見最早鑒定的是α α es、α α QS。α α QS是α 2基因第125密碼子CTG(亮氨酸)突變?yōu)镃CG (脯氨酸)，是一種高度不穩(wěn)定的α -珠蛋白，阻礙α 1 β 1 二聚體的形成，從而影響四聚體的合成；而α aes是α 2基因終止密碼突變，使α鏈延長為172個(gè)氨基酸。這種突變基因轉(zhuǎn)錄的mRNA不穩(wěn)定，導(dǎo)致α鏈障礙。
β地貧是一種由β珠蛋白(β-Globin)基因異常導(dǎo)致肽鏈表達(dá)失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由珠蛋白基因點(diǎn)突變所致。目前在中國發(fā)現(xiàn)的突變類型有27種，最常見的突變有 CD41/42(41. 6% )、IVSII-654(21. 8% )、CD17(18. 0% )、TATA 28(8. 0% )、 CD71/72(3. 9% ),TATA 29(1. 2% )等，其它突變類型(5. 5% )
目前用于單獨(dú)檢測(cè)α突變型地貧均為科研試劑，可檢測(cè)α α cs, α α QS、α α 三種突變型別，而在中國人群中也有報(bào)道的α am3°、α α CD3/ α α GD59三種型別沒有納入檢測(cè)范圍。檢測(cè)β突變型地貧目前存在商品化的試劑盒，但最多僅能夠檢測(cè)其中的17 種，對(duì)于一些少數(shù)民族地區(qū)和新近發(fā)現(xiàn)的突變無法檢測(cè)，如新疆發(fā)現(xiàn)的⑶8(_ΑΑ)發(fā)生率
516.6% (李厚鈞等，1994)，CD8/9(+G)(余伍忠等，1996)，廣東發(fā)現(xiàn)的CD71/72(+T)(張力等，2008)，CD37(G —A)(鐘惠珠等，2009)等。同時(shí)對(duì)于一些其它類別的突變，如IVSII_5、 41/42 (-TTCT)和IVSII-5(G — C)雙重雜合子突變，目前商品化試劑盒也無法檢測(cè)，僅有學(xué)者在做少量的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究。
曲敬等公開了“用于診斷地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒”(公開號(hào) CN 1718742Α)，該試劑盒僅檢測(cè)中國的17種突變型別；楊夢(mèng)蘇公開了 “用于診斷地中海貧血的DNA芯片及其制備方法”(公開號(hào)CN1453363A)可檢測(cè)在中國發(fā)現(xiàn)的21種類型的突變。這兩個(gè)專利難以實(shí)現(xiàn)商品化，是因?yàn)樗鼈兌即嬖诠餐牟蛔悴荒軝z測(cè)中國發(fā)現(xiàn)的27 種型別的突變，而且其探針設(shè)計(jì)需要通過大量的探針篩選才能得到比較滿意的結(jié)果；均把 β-Globin基因擴(kuò)增為兩段，其中一段為600bp左右，而另一段為400bp左右。在雜交過程中，片段長度越長，雜交效率就越低，尤其是以玻片為載體的基因芯片，經(jīng)驗(yàn)上的數(shù)值是不超過400bp，而為了彌補(bǔ)雜交效率不足，相應(yīng)的措施是延長雜交時(shí)間，但這一措施并不適合于快速檢測(cè)的初衷。
雖然β地貧突變檢測(cè)試劑國內(nèi)有數(shù)個(gè)廠家生產(chǎn)和銷售，α突變型地貧也有一些科研試劑，但由于技術(shù)方法的局限，國內(nèi)尚沒有一次性完成檢測(cè)的一體化試劑，往往要多個(gè)試劑盒多次檢測(cè)才能完成，繁雜又耗資耗時(shí)，因此本發(fā)明開發(fā)一種一體化檢測(cè)α、β地中海貧血核苷酸多態(tài)性的試劑盒。同時(shí)由于α地貧和β地貧少見突變型不僅是客觀存在的， 而且可能由于缺乏有效的檢測(cè)手段，沒有深入研究而被忽略，為全面提高人口素質(zhì)，有必要完善檢測(cè)位點(diǎn)的覆蓋率，因此該發(fā)明的試劑盒還具有高覆蓋率的特點(diǎn)，可以檢測(cè)6種α地貧點(diǎn)突變和27種β地貧突變，以滿足臨床應(yīng)用的需求。
本發(fā)明的試劑盒以尼龍膜為基底的核酸雜交膜條技術(shù)，其主要的基本原理如下 寡核苷酸探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標(biāo)記。經(jīng)活化處理的尼龍膜帶有羧基，探針的氨基對(duì)羧基形成親核攻擊脫水后形成酰胺鍵從而將探針結(jié)合到膜上。PCR引物的5'末端帶有生物素等標(biāo)記基團(tuán)，PCR反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物均帶有生物素標(biāo)記。
PCR產(chǎn)物與探針的結(jié)合過程可分為兩個(gè)階段，第一階段在一定的溫度下產(chǎn)物與探針互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，這一階段的結(jié)合沒有選擇性，也就是說，只有部分互補(bǔ)配對(duì)也可以結(jié)合在探針上；第二階段為特異性的洗脫階段。第一階段的非特異性結(jié)合中，當(dāng)完全互補(bǔ)配對(duì)，則 PCR產(chǎn)物與探針的結(jié)合力強(qiáng)于部分結(jié)合，通過一定的溫度和離子強(qiáng)度，將部分結(jié)合的PCR產(chǎn)物洗脫而完全互補(bǔ)配對(duì)的PCR產(chǎn)物因結(jié)合力強(qiáng)而不被洗脫。接下來通過辣根過氧化物酶結(jié)合于生物素基團(tuán)，將PCR產(chǎn)物帶上一個(gè)連接的辣根過氧化物酶，因辣根過氧化物酶在尼龍膜中存在物理吸附，需要用緩沖液將物理吸附的辣根過氧化物酶洗脫。最后一步為加入酶的底物，進(jìn)行顯色反應(yīng)。
目前國內(nèi)外基于膜雜交的商品化試劑均采用上述的原理，本發(fā)明在該技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，解決了雜交過程冗長的問題。同時(shí)在中國發(fā)現(xiàn)的6種α地貧突變型和27種類型的β地貧突變中，6種α地貧和17種β地貧為單堿基突變，且α珠蛋白基因GC含量極高，部分探針超過70%，導(dǎo)致Tm值較高，使探針在同一條件下完成雜交本身就是件難以做到的工作。因此，有必要探索更為有效的探針設(shè)計(jì)方法。郭學(xué)敏等公開了“一種寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)方法”(公開號(hào)CN 1461811A)，該方法是在突變位點(diǎn)以外設(shè)計(jì)一個(gè)或多個(gè)人工突變，形成雙突變或者多突變位點(diǎn)，但這樣仍然無法有效的區(qū)分C — G后形成的G. G錯(cuò)配。本
6發(fā)明的試劑盒同時(shí)解決了這一技術(shù)難點(diǎn)。
本發(fā)明人通過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)探索，成功開發(fā)了一種利用一種不對(duì)稱擴(kuò)增的方法一體化檢測(cè)α、β地中海貧血核苷酸多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)6種α地貧點(diǎn)突變和27種β地貧突變，檢測(cè)過程更加快速，檢測(cè)結(jié)果也更為準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種一體化檢測(cè)α、β突變型地中海貧血的試劑盒，利用本試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)6種α地貧點(diǎn)突變和27種β地貧突變。
為了解決上述任務(wù)，本發(fā)的具體技術(shù)路線為
1)分別根據(jù)α -Globin和β -Globin基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，設(shè)計(jì)的引物能夠包括α-和β-地中海貧血全部突變位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物可由專業(yè)的合成公司合成，如上海生工等。對(duì)上述引物的下游部分或上游和下游進(jìn)行生物素或其它基團(tuán)的標(biāo)記，使得擴(kuò)增的產(chǎn)物中含有相應(yīng)的標(biāo)記，以便在雜交后對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析。
2)在包含所述引物的PCR試劑中，使用兩管三重不對(duì)稱PCR進(jìn)行擴(kuò)增，不對(duì)稱PCR 的一個(gè)突出優(yōu)勢(shì)為PCR完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有可與α-Globin和β-Globin基因突變探針特異性結(jié)合的DNA序列，可直接用于雜交實(shí)驗(yàn)而不需要通過熱變性或者堿變性。PCR反應(yīng)試劑涉及的組分可以使用市售的產(chǎn)品，如ΝΕΒ公司生產(chǎn)的Taq 5XMaster Mix, Fermentas 公司生產(chǎn)的熱啟動(dòng)酶等。
3)根據(jù)α -Globin和β -Globin基因基因多態(tài)性的突變類型及相應(yīng)的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，設(shè)計(jì)的探針可以在正義鏈和/或反義鏈。設(shè)計(jì)的探針可由專業(yè)的合成公司合成，如上海生工等。
4)將上述探針點(diǎn)在經(jīng)過活化的雜交膜上，加入擴(kuò)增產(chǎn)物后，在雜交體系中，通過高濃度的鹽離子溶液非選擇性的結(jié)合靶基因，然后通過低濃度的鹽離子濃度進(jìn)行選擇性的洗脫，再交聯(lián)特異性結(jié)合的酶，最后加入酶的底物顯色。
為了完成上述檢測(cè)步驟，本發(fā)明提供的一體化檢測(cè)α、β突變型地中海貧血的試劑盒由PCR試劑、低密度芯片、雜交試劑三部分組成。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，PCR試劑包括α-PCR管和β-PCR管，其中 α -PCR管由三對(duì)α -PCR引物、酶及PCR反應(yīng)的其它常規(guī)組分組成，β -PCR管由三對(duì)β -PCR 引物、酶及PCR反應(yīng)的其組分組成，其特征在于三對(duì)α-PCR引物分別為a2F和a 2R，a Fl 和a Rl, aF2禾口 aR2，三對(duì)β-PCR引物分別為IF-β和IRm禾口 2R_3，3F_3和 3R-3，序列如下
權(quán)利要求
1.一種一體化檢測(cè)α、β突變型地中海貧血的試劑盒，由PCR試劑、低密度芯片、雜交試劑組成，其中PCR試劑包括α-PCR管和β-PCR管，α-PCR管由三對(duì)α-PCR引物、酶及 PCR反應(yīng)的其它常規(guī)組分組成，β-PCR管由三對(duì)β-PCR引物、酶及PCR反應(yīng)的其它常規(guī)組分組成，其特征在于三對(duì)α-PCR引物分別為a2F和a 2R，a Fl和a Rl, a F2和aR2，三對(duì)β -PCR引物分別為IF- β禾口 IR- β，2F- β禾口 2R- β，3F- β禾口 3R- β，序列為a 2F 5' -GGTGGAGGGTGGAGACGTCCTGGCC-3‘ a 2R 5' -CACCTCCATTGTTGGCACATTCCGGGA-3‘ a Fl 5' -GCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAG-3‘ a Rl 5' -GTGCGCGTGCAGGTCGCTCAGGGCGGACAG-3‘ a F2 5' -CTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACT-3‘ a R2 5' -GCTGCTGCCCACTCAGACTTTATTCAAAG-3‘ IF-β 5' -AGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGG-3‘ IR-β 5' -CCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACC-3‘ 2F-0 5' -GATAGGCACTGACTCTCTCTGC-3‘ 2R-3 5' -GAACTTAACCATAGAAAAGAAGG-3‘ 3F-0 5' -GTATCATGCCTCTTTGCACCATTC-3‘ 3R-0 5' -CACACAGACCAGCACGTTGCCCAGGAGC-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其特征還在于PCR試劑中引物a2F，a2R終濃度為 0·2μΜ，弓丨物 a Fl, a F2, IF-β，2F-3 禾口 3F-3 終濃度為 0· 01 μ Μ，弓丨物 a Rl, a R2, IR-β， 2R- β和3R- β終濃度為0. 2 μ Μ。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其特征還在于PCR試劑中的酶為熱啟動(dòng)酶或Taq酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其中低密度芯片由膜、點(diǎn)在膜上的檢測(cè)a、 β -Globin基因突變位點(diǎn)的特異性探針組成，其特征在于特異性探針的序列為■cod30N5'-GGCCCTGGAGAGGTGAG-3'■cod30M5'-AGGCCCTGAGGTGAGG-3'■cod31N5'-CCTGGAGAGGTGAGGCT-3'■cod31M5'-CCTGGAGAAGTGAGGCT-3'■cod59N5'-GGGCCACGGCAAGAAGG-3'■cod59M5'-GGGCCACGACAAGAAGG-3'-WM-codl22N5'-GCGGTGCACGCCTCCCT--3'-WM-codl22M5'-GCGGTGCAGGCCTCCCT--3'-QS-codl25N5'-CGCCTCCCTGGACAAGT--3'-QS-codl25M5'-CGCCTCCCCGGACAAGT--3'-CS-codl42N5'-AATACCGTTAAGCTGGAGC--3-CS-codl42M5'-AATACCGTCAAGCTGGAGC--3ΤΑΤΑ32-Ν 5 ‘ -TGGGCATAAAAGTCAGTG-3‘ ΤΑΤΑ32-Μ 5 ‘ -TGGGAATAAAAGTCAGGTG-3‘ ΤΑΤΑ30-Ν 5‘ -GGCATAAAAGTCAGGGCTA-3‘ ΤΑΤΑ30-Μ 5‘ -GGCACAAAAGTCAGGGCTA-3‘TATA29-N 5‘ -GCATAAAAGTCAGGGCATG-3‘ TATA29-M 5‘ -GCATGAAAGTCAGGGCATG-3‘ TATA28-N 5‘ -GCATAAAAGTCAGGGCAGATG-3‘ TATA28-M 5‘ -GCATAGAAGTCAGGGCAGATG-3‘ Cap+1-N 5' -CTATCTATTGCTTACATTTG-3‘ Cap+1-M 5' -CTATCTATTGCTTCCATTTG-3‘ Cap40-43-N 5‘ -GCAACCTCAAACAGACA-3‘ Cap40-43-M 5‘ -GCAACCTCAGACACCAT-3‘ Innitiation-N 5 ‘ -CTAAACAGACACCATGGTG-3‘ Innitiation-M 5 ‘ -CTAAACAGACACCAGGGTG-3‘ CD8-N 5‘ -CTGAGGAGAAGTCTGC-3‘ CD8-M 5‘ -CTGAGGAGGTCTGCCG-3 ‘ CD8/9-N 5‘ -CTGAGGAGAAGTCTGC-3‘ CD8/9-M 5‘ -TGAGGAGAAGGTCTGC-3‘ CD14/15-N 5‘ -TTACTGCCCTGTGGG-3‘ CD14/15-M 5' -TTACTGCCCTGGTGG-3‘ CD17-N 5' -CTCCTGTGGGGCAAGGTGA-3‘ CD17-M 5‘ -CTCCTGTGGGGCTAGGTGA-3‘ CD19-N 5' -GGTGAACGTGGATGAAGTTAG-3‘ CD19-M 5' -GGTGGACGTGGATGAAGTTAG-3‘ CD26-N 5‘ -GTAAGTTGGTGGTGAGGC-3‘ CD26-M 5‘ -GTAAGTTGGTGGTAAGGC-3‘ CD27/28-N 5' -TGGTGAGGCCCTGG-3‘ CD27/28-M 5' -TGGTGAGGCCCCTG-3‘ CD30-N 5‘ -CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3‘ CD30-M 5‘ -CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3‘ CD31-N 5' -CTTAGGCTGCTGGTGGTC-3‘ CD31-M 5' -CCTTAGGTGCTGGTGGTC-3‘ CD37-N 5' -CCTTGGACCCAGAGGTTAC-3‘ CD37-M 5' -CCTTAGACCCAGAGGTTAC-3‘ CD41-N 5‘ -TGGACCCAGAGGTTCTTTG-3‘ CD41-M 5' -TGGACCCAGAGGTTTCTTTG-3‘ CD41/42-N 5‘ -GGTTCTTTGAGTCCTTTG-3‘ CD41/42-M 5' -GGTTGAGTCCTTTGGGGA-3‘ CD43-N 5' -CTTTGAGTCCTTTGGGGACT-3‘ CD43-M 5' -CTTTTAGTCCTTTGGGGACT-3 ‘ 71/72-N 5' -GGTGCCTTTAGTGATGG-3‘ 71/72-M 5' -TCGGTGCCTTTTAGTGATG-3‘ CD95-N 5' -ACTGTGACAAGCTGCAC-3‘CD95-M 5 ‘ -ACTGTGACAAAGCTGCAC-3‘ IVSI-I-N 5' -GGCAGGTTGGTATCAAGT-3‘ IVSI-I-M 5' -GGCAGTTTGGTATCAAGT-3‘ IVSII-I-N 5' -GTTGGTATCAAGGTTACTA-3‘ IVSII-I-M 5' -GTTGCTATCAAGGTTACAA-3‘ IVSII-5-N 5' -GTAACTTCAGGGTGAGTCT-3‘ IVSII-5-M 5' -GTAACTTCAGGGTGACTCT-3‘ IVSII-nt654-N 5 ‘ -TAAGGCAATAGCAATATAC-3‘ IVSII-nt654-M 5 ‘ -TAAGGTAATAGCAATATAC-3‘ 顯色控制點(diǎn)5' -GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3 ‘。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其特征還在于低密度芯片中特異性探針的點(diǎn)樣量為 5pmolο
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其特征還在于低密度芯片中膜的材料為硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其中雜交試劑由雜交液I、雜交液II、酶、顯色液組成，其特征在于雜交液I的組成為2XSSC，0. 5% SDS，雜交液II的組成為0. 5X SSC, 0. 5% SDS。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其特征還在于雜交試劑中酶為辣根過氧化物酶，用量為0. IU0
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的試劑盒，其特征還在于顯色液中顯色底物包括TMB或0PD。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種一體化檢測(cè)α、β突變型地中海貧血的試劑盒，特別是涉及一種利用多重不對(duì)稱擴(kuò)增及反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)α、β地中海貧血突變型的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒由PCR試劑、低密度芯片、雜交試劑三部分組成，包含一套特異性核苷酸多態(tài)性探針和擴(kuò)增樣品中靶基因的PCR引物，可以同時(shí)檢測(cè)中國常見的6種α地貧點(diǎn)突變和27種β地貧突變。由于本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)過程更加快速，檢測(cè)結(jié)果也更為準(zhǔn)確，將廣泛應(yīng)用于臨床地中海貧血的診斷及優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102220411SQ201010152735
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2010年4月16日
發(fā)明者何蘊(yùn)韶, 張?zhí)? 彭春梅, 李明, 林炳生, 程鋼, 陳華云 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan