專利名稱:利用屎腸球菌生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，特別是利用屎腸球菌CEyitow^cc附/股c/H/n)生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸(Y-Aminobutyricacid，GABA)，又叫氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理功能，如降低血壓、利尿、鎮(zhèn)痛安神、改善腦機能、增進腦活力、促進長期記憶、營養(yǎng)神經(jīng)細胞、改善更年期綜合癥等。當大腦長期缺乏GABA將會導致癲癇、帕金森等疾病。同時GABA還與腦衰老有關(guān)，其缺乏將導致老年人"耳不聰、目不明"。另外，GABA能促進精子的穿卵能力，提高受精率，用于掩飾或降低具有不愉快味道的物質(zhì)的不愉快風味印象的用途以及可以提高飼料利用率和日增重。，氨基丁酸正被廣泛運用于醫(yī)藥、食品保健、化工及農(nóng)業(yè)等行業(yè)。GABA的生產(chǎn)主要可以通過化學合成和生物合成兩條途徑?；瘜W合成反應條件劇烈，采用的化學溶劑具有毒性和腐蝕性，副產(chǎn)物多，缺乏安全性，主要應用于化工行業(yè)；生物合成法較化學合成法具有條件溫和、環(huán)境污染相對較低、安全性高等優(yōu)點。另外，由于微生物具有生長速度快、生長條件較簡單、代謝過程特殊和分布廣等特點，因此利用微生物生產(chǎn)GABA，不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有顯著的優(yōu)點。
目前已經(jīng)有一些利用不同種屬的微生物生產(chǎn)GABA的報道。
陸兆新、楊勝遠等在中國專利(專利號ZL200510040758.9)中公開了一種？氨基丁酸的生產(chǎn)方法，它是以唾液鏈球菌嗜熱亞種(S的ptoc"c附Ae簡叩/^7"J)為菌種，作用于谷氨酸、谷氨酸鹽、含谷氨酸或谷氨酸鹽的物質(zhì)，使谷氨酸的a-羧基發(fā)生脫羧作用，從而生成？氨基丁酸。
吳天樣等在中國專利(公開號CN101240301)中公開了固態(tài)發(fā)酵制備7-氨基丁酸的方法，包括如下步驟首先以腐乳為原料篩選出紅曲霉菌種；接著將紅曲霉MP1104菌種置于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，使菌種活化；然后發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，在溫度30'C、轉(zhuǎn)速150r/min下將活化菌種搖床培養(yǎng)2d,制備發(fā)酵種子，優(yōu)選固態(tài)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基；最后將菌種在上一步驟中優(yōu)選的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)生產(chǎn)GABA。該方法以大米為發(fā)酵原料，以紅曲霉為菌種，具有食用安全性，可以作為保健食品直接食用；該方法的GABA產(chǎn)量和純度均高，在最佳發(fā)酵條件與培養(yǎng)基下，GABA產(chǎn)量由初始的0.21mg/g可達到0.35mg/g，最終產(chǎn)品的純度可以達到45%。
焦慶才等在中國專利(專利號ZL 200410064813.3)中公開一種廣氨基丁酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，該制備方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸兩種混合酸性氨基酸作為原料，將具有高活力
31^-谷氨酸脫羧酶的埃希氏菌￡^^/^/ ' 0 //八81.505的菌體細胞與含有1^谷氨酸和1^天冬氮 酸混合物的轉(zhuǎn)化液混合，28-45'C下進行酶促反應，然后用等電點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離子 交換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的"氨基丁酸和L-天冬氨酸。該方法解決 了兩種酸性混合氨基酸高效分離的難題，得到了附加值較高的Y-氨基丁酸，并具有原料價格 低廉，操作簡便，轉(zhuǎn)化時間短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
梅樂和等在中國專利(專利號ZL 200510049187.5)中公開了一種生物合成Y-氨基丁酸的方 法，其特征在于:保藏編號為CGMCC NO.1306的短乳桿菌(l^cto6flc,'〃M 6rev/s)，經(jīng)瓊脂斜 面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基或MRS種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 30小時后，以0.5% 5%的接種量接種于GYP或MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25'C 35。C下靜置培養(yǎng)48h 120h，即 得含菌體的發(fā)酵液，菌體離心分離收集；離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.25 2g濕菌體，懸浮于15 50mL的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為5mM 60mM,反應1 10小時，反應液離心即得含Y-氨基丁酸的溶液。梅樂和等在中國專利(專利 號ZL200510049187.5)中還公開了一種控制pH發(fā)酵生產(chǎn)？氨基丁酸的方法。其特征在于:保 藏編號為CGMCCNO.1306的短乳桿菌(Zrtc勿Mc/〃"^ 6"v/s)，經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn) 接于GYP種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 35小時后，以5 10%的接種量接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵 罐裝液量為1 3L，攪拌轉(zhuǎn)速為50 150r/min，在30'C下靜置培養(yǎng)，對其進行pH控制發(fā)酵， 發(fā)酵培養(yǎng)約25 40小時，待菌體生長進入穩(wěn)定期，pH值回升后，連續(xù)流加1 3mol/L的鹽 酸，發(fā)酵培養(yǎng)基pH控制在5.0 5.6，繼續(xù)培養(yǎng)約40 60h，即得含Y-氨基丁酸的發(fā)酵液。
郭曉風等在中國專利(專利公開號CN101102683)中公開了一種涉及含有Y-氨基丁酸的 食品的生產(chǎn)方法，其包括使酵母或其處理物作用于糖和/或糖代謝中間體，或者是作用于糖或 糖代謝中間體和谷氨酸或其鹽，其中，上述酵母具有在糖或糖代謝中間體存在下通過發(fā)酵反 應生產(chǎn)Y-氨基丁酸的能力。
蔣冬花等在中國專利(專利公開號CN101302480)中公開了一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸紅色紅 曲霉Mr-5菌株及其篩選方法和用途。該發(fā)明的高產(chǎn)GABA紅色紅曲霉(AToo"W7w Mr-5) 菌株，其保藏編號為CCTCCNO: M208043，保藏地為中國典型培養(yǎng)物保藏中心。另外 還公開了上述的紅色紅曲霉Mr-5菌株的篩選方法以及用途和用于Y-氨基丁酸的合成的方法， 采用生物法合成Y-氨基丁酸的方法所得的發(fā)酵液中含6~9g/L的Y-氨基丁酸。
崔曉俊等在中國專利(專利公開號CN101311273)中公開了一種生物合成的"r氨基丁酸 制劑的方法，該產(chǎn)品按重量百分比含有5%至60%的Y-氨基丁酸。上述的生物合成的Y-氨 基丁酸制劑的制備方法按以下步驟進行首先將乳酸鏈球菌種接種到250mL由葡萄糖、玉 米漿粉、脫脂豆粕粉、味精組成的發(fā)酵種子培養(yǎng)基，形成發(fā)酵液，將發(fā)酵液引入高速離心機 中離心形成清液，將清液在40。C下，加入250mg/L殼聚糖，攪拌絮凝，將經(jīng)絮凝的待濾發(fā) 酵液通過板框過濾機，得到濾清液，濾清液經(jīng)陽離子樹脂交換床進行離子交換，待離子交換 樹脂飽和后，去離子水洗脫，將谷氨酸全部洗脫，然后用氨水洗脫提取Y-氨基丁酸。
曹郁生等在中國專利(專利公開號CN101333508)中公開了一種高產(chǎn)y-氨基丁酸的短乳
桿菌，其特征和工藝方法步驟為經(jīng)鑒定為ifl"0^c/〃Ms6m^(短乳桿菌)，國家菌種保藏號Z^"o6rt"7/HJS CCTCCM 208054。將保藏于MRS瓊脂斜面的短乳桿菌，轉(zhuǎn)接于MRS
液體培養(yǎng)基，經(jīng)活化后，以2-5Y。的接種量接種于MRSG液體培養(yǎng)基，于25-3(TC培養(yǎng)60-90h，發(fā)酵液中的7-氨基丁酸達到50-145mM。曹郁生等還在中國專利(專利公開號CN101333548)中公開了一種利用短乳桿菌制備Y-氨基丁酸的方法，其工藝方法步驟為l.利用MRS液體培養(yǎng)基將短乳桿菌活化后，以5%的接種量接種于MRSG發(fā)酵培養(yǎng)基，34"C培養(yǎng)40-60h， 4°C離心收集菌體；2.利用無菌生理鹽水洗漆2次后懸于含10-100mM谷氨酸鈉、pH 5.2的醋酸緩沖液中，34'C反應l 8h,離心后即為含Y-氨基丁酸的溶液。
趙景聯(lián)等在文摘(生物工程學報，1989,5(2): 124-128)中報道了用海藻酸鈣包埋法將大腸桿菌細胞制成固定化細胞，與1%谷氨酸溶液進行間歇反應、連續(xù)攪拌式反應及連續(xù)柱式反應生產(chǎn)GABA。間歇反應5h轉(zhuǎn)化率達到了 100%;連續(xù)攪拌式反應在三角瓶反應器中進行，以6ml/h的流速輸入底物溶液和輸出反應液，轉(zhuǎn)化率達85%;連續(xù)柱式反應器中進行，控制流速12ml/h，轉(zhuǎn)化率達95%。
章汝平等在文摘(長沙電力學院學報(自然科學版)，1998,13(4): 433-435)中報道了用海藻酸鈣包埋法將大腸桿菌細胞制成固定化細胞，對后道味精母液提取谷氨酸后的廢液進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA，獲得了 GABA含量達到了 98.94%，收率為49.65%。
Kono I等在文摘(5/仍c/. J5/otecA"< /.B/ocAe"i.，2000，64(3):617-619)中介紹了對Koji制作中GABA的變化，GABA含量達到了 120jig/g 。
Wang JJ等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol， 2003,30:669-676)中報道了利用pti/pMmw NTU 601進行固體發(fā)酵，GABA含量達到了 5004mg/kg。
SuYC等在文摘(J/m/M/cro6,Wfi/otec/^10/， 2003,30(1): 41-46)中報道了采用Afo"fl^"s/jm"mm"s CCRC31615進行固體發(fā)酵，GABA含量達到了 1200mg/kg。
Nomura M等在文摘(Ji)mVj; &/.,1998，81:1486-1491)中介紹了從生產(chǎn)奶酪的菌株中分離到一株JLac似cocc"s /flc似01-7，用于奶酪生產(chǎn)，奶酪的GABA的含量達到了 383mg/kg。
許建軍在其博士學位論文(江南大學，2004年2月)中報道了從乳酸菌中篩選到了高產(chǎn)GABA的/flc他菌株，25L罐發(fā)酵72h，發(fā)酵液的GABA達到了 250mg/100ml。
劉清等在文摘(氨基酸和生物資源，2004， 26(1): 40-43)中也對高產(chǎn)GABA乳酸菌篩選和發(fā)酵條件進行了報道，發(fā)酵液中的GABA達到3.1g/l。
Yokoyama S等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering， 2002， 93(1): 95-97)中報道了利用hcto6flc/〃"s 6m^y IFO-12005對酒糟進行發(fā)酵，GABA的含量達到了 10.18mM，通過離心、絮凝、脫色和脫臭處理獲得了較好的GABA溶液，可用于食品強化GABA。
愛宕世高等在文摘(食品t科學，2001，No.8, 81-85)中報道了采用iflcto6 c///"sp/fl/i紐nwn利用含有米糠抽提液的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)GABA，在干粉含量達到了 5%。
Komatsuzaki N等在文摘(i^orfAf/m^V^^v, 2005,22:497-504)中報道了從日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離到了丄flc似6fla7/w戸raowe/用于GABA生產(chǎn)，GABA濃度達到了 302mM。
Takahashi T等在文摘(Towmfl/ o/Sf'osci'e ce flttrf Bi'oerag/w"n'rtg， 2004,97(6): 412-418 )中報道篩選到了 Sflcc/iflramj;c" ce"Ww'fle UT-1的GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶缺陷突變型菌株GAB7-1和GAB7-2，其發(fā)酵液中GABA濃度分別達到了 0.4mM和0.42mM，較野生 株分別提高了2.0和2.1倍。
Ijsseldijk等在美國專利(United States Patent, US5472718A)中公開了利用含有保加利 亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的酸奶加入到牛奶中，生產(chǎn)奶酪，所獲得的奶酪具有較大的多孔性結(jié) 構(gòu)，質(zhì)地大大改善，并在其中檢測到了微量GABA。
有關(guān)屎腸球菌(E"&ra"cc":y/flee/Mm)的報道方面，中國專利申請?zhí)?0114138公開了 一種經(jīng)分離篩選的屎腸球菌(CCTCCNO:M99016)及其應用。經(jīng)培養(yǎng)基選擇、糞便(豬) 樣品采集、接種及培養(yǎng)篩選，其特征是分別經(jīng)膽汁耐受性、耐酸性、安全性篩選、檢測獲 得能應用于制造畜禽胃腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的特殊屎腸球菌純培養(yǎng)物。并在此基礎上，制成仔 豬生態(tài)調(diào)節(jié)膏劑、畜禽飼料添加劑等。但目前尚未見有利用屎腸球菌生產(chǎn)7-氨基丁酸的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供利用屎腸球菌細胞或其谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化外源谷氨酸或谷氨酸鈉 生產(chǎn)，氨基丁酸的方法，可以生產(chǎn)高含量的？氨基丁酸，大大降低生產(chǎn)成本，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。轉(zhuǎn)化液成分簡單，無毒副產(chǎn)物，只需對其GABA進行簡單的提取和純化即可做為食用 添加劑。
本發(fā)明人通過自行從泡菜中分離或從微生物菌種保藏中心經(jīng)過購買屎腸球菌 (五MteJwocc"s /fledum)進行試驗，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)屎腸球菌(EWett)coccMS /aeciwm)都具有較高的 谷氨酸脫羧酶活性。通過進一步研究確定了屎腸球菌(E"&racocc附/""/"柳)轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)Y-氨 基丁酸溶液的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的方法是利用含有高谷氨酸脫羧酶活性的屎腸球菌細胞或其谷氨酸脫羧酶直接轉(zhuǎn) 化底物，只需提供合適的緩沖條件或通過滴加酸堿控制反應pH，轉(zhuǎn)化體系中成分少，副產(chǎn) 物少，無有害物質(zhì)存在，作為食品、藥品的原材料安全、可靠。整個工藝流程消耗的物質(zhì)和 能量少，產(chǎn)生的廢棄物少，有利于環(huán)保。
本發(fā)明的獲得的Y-氨基丁酸的分子量為103.1,結(jié)構(gòu)式為
NH2
HOOC—CH2—CH廣CH2
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的通過屎腸球菌(JE:M/ewco"HS /aed"m)或其谷氨酸脫羧酶作用于谷 氨酸或谷氨酸鈉，使谷氨酸或谷氨酸鈉發(fā)生脫羧基作用生成？氨基丁酸。
氨基丁酸的生產(chǎn)方法有如下形式
一、 通過采用MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){等培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后， 離心收集菌體，參照《酶工程》(郭勇主編，中國輕工業(yè)出版社，2000年)所述方法對屎腸 球菌的谷氨酸脫羧酶進行提取。然后將酶液與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，在pH3.0~5.5， 30 60'C下進行攪拌反應lh 3d，從而獲得Y-氨基丁酸。
二、 通過采用MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){等培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后， 離心收集菌體，將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的溶液或懸濁液混合，然后在pH3.0~5.5， 30~60°C下進行攪拌反應l 6d，從而獲得含Y-氨基丁酸的溶液。本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)屎腸球菌具有很高的谷氨酸脫羧酶活性，利用其作為菌種，作用于外源^加的谷氨酸或谷氨酸鈉，可以生產(chǎn)高含量的Y-氨基丁酸(最高濃度可達30%)，可以大大降低生產(chǎn)成本。轉(zhuǎn)化液的成分簡單，便于后提取工藝的簡化。細胞轉(zhuǎn)化反應可在高濃度谷氨酸或谷氨酸鈉底物中進行，底物濃度高，可提高設備的利用率，產(chǎn)物濃度高，可節(jié)約能耗，大大降低生產(chǎn)成本。
具體實施方式
實施例1:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，參照《酶工程》(郭勇主編，中國輕工業(yè)出版社，2000年)所述方法對屎腸球菌的谷氨酸脫羧酶進行提取。然后將酶液與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，在pH3.0 5.5， 30~60'C下進行攪拌反應lh 3d，即可得到濃度為1%~20% Y-氨基丁酸溶液。
實施例2:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，在pH3.0~5.5， 30^60。C下進行攪拌反應l 4d，離心分離菌體，即可得到濃度為1°/。~30%的，氨基丁酸溶液。
實施例3:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，加入適量吐溫(Tween)、蔗糖酯或特里頓(Triton)等表面活性劑，在pH3.0 5.5, 20 80'C下進行攪拌反應l一d，離心分離菌體，即可得到濃度為1%~30%的Y-氨基丁酸溶液。
實施例4:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，采用0.5~10%的甲苯處理，再離心收集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，加入適量吐溫(Tween)、蔗糖酯或特里頓(Triton)等表面活性劑，在pH3.0~5.5， 30~60'C下進行攪拌反應l 4d，離心分離菌體，即可得到濃度為1%~30%的，氨基丁酸溶液。
實施例5:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，采用0.5~10%的甲苯處理，再離心收集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，在pH3.0 5.5, 30 60r下進行攪拌反應l 4d。整個反應中，滴加消泡劑進行消泡。反應結(jié)束后，離心分離菌體，即可得到濃度為P/。 30y。的Y-氨基丁酸溶液。
實施例6:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的懸濁液混合(半固體狀態(tài))，在pH3.0~5.5, 30~60'C下進行攪拌反應l~6d，離心分離菌體，即可得到濃度為1%~30°/。的？氨基丁酸溶液。 實施例7:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的懸濁液混合(半固體狀態(tài))，加入適量吐溫(Tween)、 蔗糖酯或特里頓(Triton)等表面活性劑，在pH3.0~5.5， 30 60'C下進行攪拌反應l~6d，離心 分離菌體，即可得到濃度為1%~30%的"/-氨基丁酸溶液。
實施例8:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，采用0.5~10%的甲苯處理，再離心收集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的懸 濁液混合(半固體狀態(tài))，加入適量吐溫(Tween)、蔗糖酯或特里頓(Triton)等表面活性劑，在 pH3.0~5.5, 30 6(TC下進行攪拌反應l~6d,離心分離菌體，即可得到濃度為1°/。 30%的， 氨基丁酸溶液。
實施例9:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，采用0.5~10°/。的甲苯處理，再離心收集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的懸 濁液混合(半固體狀態(tài))，在pH3.0 5.5, 30—0'C下進行攪拌反應l~6d，整個反應中，滴加 消泡劑進行消泡。反應結(jié)束后，離心分離菌體，即可得到濃度為1%~30%的7-氨基丁酸溶液。
實施例10:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，采用0.5~10%的甲苯處理，再離心收集菌體，然后將菌體進行固定化，以pH3.0 5.5 的谷氨酸或谷氨酸鈉溶液，于30 60'C反應，離心或過濾分離固定化細胞，即可得到含Y-氨 基丁酸的溶液，或者將固定化細胞裝柱，在通過流加谷氨酸或谷氨酸鈉溶液(pH3.0~5.5), 于30 6(TC下進行連續(xù)或間歇式反應，可得到濃度為1V。~10% ，氨基丁酸溶液。
實施例11:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆槳擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，然后將菌體進行固定化，與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，在口113.0~5.5條件下，于 304(TC反應，離心或過濾分離固定化細胞，即可得到含Y-氨基丁酸的溶液，或者將固定化 細胞裝柱，在通過流加谷氨酸或谷氨酸鈉溶液(pH3.0~5.5),于30^0'C下進行連續(xù)或間歇 式反應，可得到濃度為1%~10%7-氨基丁酸溶液。
實施例12:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，采用0.5~10%的甲苯處理，再離心收集菌體，然后將菌體進行固定化，與谷氨酸或 谷氨酸鈉溶液混合，在pH3.0~5.5條件下，于30 60'C反應，離心或過濾分離固定化細胞， 即可得到含Y-氨基丁酸的溶液，或者將固定化細胞裝柱，在通過流加含適量吐溫(Tween)、蔗 糖酯或特里頓(Triton)等表面活性劑的谷氨酸或谷氨酸鈉溶液(pH3.0~5.5)，于30 60'C下進 行連續(xù)或間歇式反應，可得到濃度為1%~10%^氨基丁酸溶液。實施例13:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的懸濁液混合(半固體狀態(tài))，在pH3.0 5.5， 30~60 。C下進行攪拌反應l~6d,當反應液中無谷氨酸顆粒存在時，采用滴加HC1和NaOH溶液控 制pH在3.0 5.5之間，繼續(xù)反應lh 2d。整個反應中，滴加消泡劑進行消泡。反應結(jié)束后， 離心分離菌體，即可得到濃度為1%~30%的？氨基丁酸溶液。
實施例14:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，然后將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的懸濁液混合(半固體狀態(tài))，在PH3.0~5.5， 30~60 。C下進行攪拌反應14d。整個反應中，滴加消泡劑進行消泡。反應結(jié)束后，離心分離菌體， 即可得到濃度為1%~30%的，氨基丁酸溶液。
實施例15:
屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){擴大培養(yǎng)后，離心收 集菌體，然后將菌體與麩酸(發(fā)酵法生產(chǎn)的谷氨酸粗提物)懸濁液混合(半固體狀態(tài))，在 pH3.0~5.5， 30 60'C下進行攪拌反應l~6d。整個反應中，滴加消泡劑進行消泡。反應結(jié)束 后，離心分離菌體，即可得到濃度為1%~30%的^氨基丁酸溶液。
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權(quán)利要求
1、利用屎腸球菌(Enterococcus faecium)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法。
2、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的屎腸球菌(E"ter^occ附/flec/"m)作為菌種發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸 的方法，其特征為以屎腸球菌(五Mterarac^w/^ci'Mm)為菌種，先對屎腸球菌進行培養(yǎng)，通 過離心獲取大量菌體，將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的溶液或懸濁液混合，然后在pH3.0~5.5， 30 60'C下進行攪拌反應，從而獲得含Y-氨基丁酸的溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的屎腸球菌(Ewteracocc附/aea'"附)作為菌種發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸 的方法，其特征為對屎腸球菌進行培養(yǎng)，獲取大量菌體，再對屎腸球菌的谷氨酸脫羧酶進 行提取，然后將酶液與谷氨酸或谷氨酸鈉溶液混合，在pH3.0 5.5, 30 6(TC下進行攪拌反應， 從而7-氨基丁酸溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的屎腸球菌(五/iterao7cc^/flea'wm)作為菌種發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸 的方法，其特征為先將屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆?jié){ 等培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，通過離心獲取大量菌體后，將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的溶液或懸濁液 混合，加入吐溫(Tween)、蔗糖酯或特里頓(Triton)等表面活性劑，然后在pH3.0~5.5， 30~60°C 下進行攪拌反應l 6d，離心分離菌體，從而獲得含？氨基丁酸的溶液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的屎腸球菌(五"towrocc附/fl"/"附)作為菌種發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸 的方法，其特征為先將屎腸球菌經(jīng)過MRS、 Lee培養(yǎng)基、馬鈴薯水提液、營養(yǎng)肉湯或豆槳 等培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，通過離心獲取大量菌體后，將菌體與谷氨酸或谷氨酸鈉的溶液或懸濁液 混合，在pH3.0~5.5， 30 60'C下進行攪拌反應，當反應液中無谷氨酸顆粒存在時，采用滴 加HCl和NaOH溶液控制pH在3.0 5.5之間，繼續(xù)反應lh 2d，整個反應中，滴加消泡劑 進行消泡，反應結(jié)束后，離心分離菌體，得到Y(jié)-氨基丁酸溶液。
專利摘要
本發(fā)明闡述了一種γ-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，它是以屎腸球菌(Enterococcus faecium)的細胞，通過細胞轉(zhuǎn)化法和酶工程技術(shù)將外源添加的谷氨酸或谷氨酸鈉進行轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)高含量的γ-氨基丁酸(轉(zhuǎn)化液γ-氨基丁酸含量達1～30％)。該法屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，無需高溫高壓反應條件和有毒有害原料，專一性高，副產(chǎn)物少，轉(zhuǎn)化液的成分簡單，便于簡化后提取工藝，產(chǎn)品安全性高，可用于化工、食品、飼料或純化后用于醫(yī)藥等行業(yè)。屎腸球菌細胞可在高濃度谷氨酸或谷氨酸鈉底物中進行轉(zhuǎn)化反應，γ-氨基丁酸濃度高，設備的利用率高，節(jié)約能耗，大大降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/01GKCN101538594SQ200910114017
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月28日
發(fā)明者云 李, 楊勝遠, 錦 韋 申請人:韓山師范學院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan