專利名稱:從啤酒廢酵母中提取核苷酸的方法
本發(fā)明涉及利用工業(yè)廢料生產(chǎn)核苷酸的方法，具體地指一種從啤酒廢酵母中提取核苷酸的方法。
啤酒廢酵母是指啤酒釀制工藝的后發(fā)酵期所排出的酵母廢水經(jīng)粗濾而剩余的殘?jiān)?，一般稱其為濕酵母泥，濕酵母泥經(jīng)滾筒等設(shè)備干燥后即成為干酵母餅。目前，對(duì)啤酒廢酵母的綜合利用處理方法很多，其中較為典型的方法是先將啤酒廢酵母進(jìn)行脫核等處理，從中得到對(duì)人體健康有良好益處的核酸、核苷酸等營養(yǎng)物質(zhì)，再將經(jīng)過處理的脫核酵母用作牲畜家禽的飼料。如公開號(hào)為CN1049521A的中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書中記載了一種利用酒廠廢酵母生產(chǎn)5′-核苷酸的方法，該方法是先采用鹽法來使?jié)窠湍改嗟募?xì)胞破裂，從中得到含核酸的提取液，然后將其中的核酸在pH值為2.5的條件下沉淀，沉淀在溶解后再利用含磷酸二酯酶的桔青霉菌發(fā)酵液對(duì)核酸進(jìn)行酶解，從而得到核苷酸混合液，最后提純混合液中的核苷酸。但該生產(chǎn)方法仍然存在如下的缺陷由于在其工藝過程中需要將核酸進(jìn)行沉淀，而核酸提取液中核酸的分子量大小不一，在同一條件下大分子的核酸較易沉淀，小分子的核酸則易游離出來從上清中排掉，這樣會(huì)有相當(dāng)一部分的核酸未能充分利用，而是在沉淀的過程中損失掉了，相應(yīng)核苷酸的收得率也較為偏低。并且核酸沉淀工藝對(duì)酵母原料中核酸大分子率的要求相當(dāng)高，使得原料的挑選工作范圍小難度大，生產(chǎn)成本增加很多。同時(shí)該工藝中所選用酶及其他化學(xué)制劑的品種、用量和使用時(shí)機(jī)較為繁雜，對(duì)最終成品的影響較大，酶及其他化學(xué)制劑在某一步驟起到特定作用后，在下一步驟則成為防礙核苷酸提純的雜質(zhì)，使得核苷酸的得率含量和純度的穩(wěn)定性較差，產(chǎn)品質(zhì)量控制難度加大。另外，該工藝中所加入的鹽份也會(huì)使提取完核苷酸后的脫核酵母味咸，品質(zhì)下降，不適于作飼料使用。
本發(fā)明的目的就是要解決上述鹽法生產(chǎn)核苷酸工藝所存在的不足，充分利用現(xiàn)有啤酒廢酵母中的有用資源，提供一種產(chǎn)品得率高、純度好、成本低、且性能穩(wěn)定的從啤酒廢酵母中提取核苷酸的方法。
為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明所研制的從啤酒廢酵母中提取核苷酸的方法，包括以下步驟1)核酸液的提取取干燥的啤酒廢酵母與6～10倍體積的水混合，攪拌成均勻的漿液，調(diào)節(jié)其pH值至7.2～7.5；然后將此漿液加熱升溫至94～96℃，保持1.5～2小時(shí)；再將其降溫至20℃～30℃，并調(diào)節(jié)其pH值至4.8～5.0；最后對(duì)此漿液進(jìn)行離心分離，分離出的清液即為含有核酸的提取液，將此核酸提取液升溫至80～90℃待用；2)磷酸二酯酶酶液的制備取重量為步驟1)所得核酸提取液中純核酸量2.8～3.2倍的利用桔青霉菌種發(fā)酵生產(chǎn)的麩皮霉，與9～10倍重量的水在40～50℃的溫度下浸泡1～2小時(shí)，然后降溫至20～30℃，濾除固體霉，再升溫使清液在70℃左右保持4～6分鐘后迅速降溫至30℃左右，隨后去除孢子，所得清液即為磷酸二酯酶酶液；3)混合酶解將步驟1)所得的核酸提取液和步驟2)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在65～75℃、pH值4.8～5.5的條件下水解1～2小時(shí)，再將其pH值調(diào)至7.2～7.8，并升溫至90℃左右，保持12～15分鐘后，迅速降溫至30～40℃，去除其中的不溶物，所得清液即為需要提純的核苷酸粗液；4)活性炭柱提純將步驟3)所得核苷酸粗液的pH值調(diào)節(jié)至1.5～3.0后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分鐘0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完畢，然后以同樣的流速用軟水洗脫去雜，再以同樣的流速換用由40～60％的酒精和0.5～1％的氨水組成的洗脫液進(jìn)行洗脫，保持炭柱在50～70℃恒溫下洗脫，直至流出液經(jīng)酒精檢測(cè)無白色渾濁為止，所得洗脫液即為濃度約為3～5％的核苷酸精液；保持此核苷酸精液的溫度為50～70℃，在真空條件下濃縮回收其中的酒精，使其中核苷酸的濃度提高至9～12％；再調(diào)節(jié)此高濃度核苷酸液的pH值至2.5～3.5，加入其體積量3～5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀；將此沉淀真空干燥即得核苷酸成品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于方法汲取了已有啤酒廢酵母的提取經(jīng)驗(yàn)，摸索出了較佳的反應(yīng)條件和較短工藝路線，在從干酵母餅中提取出核酸液后，直接用磷酸二酯酶酶液對(duì)其進(jìn)行定向酶解，再用活性炭柱分離提純核苷酸。由于減少了中間沉淀核酸的步驟，避免了該過程中大量核酸的流失，充分利用了提取液中的所有核酸，使得核苷酸的提取率大幅上升；并且不經(jīng)中間沉淀核酸的步驟，也極大地減少了對(duì)啤酒廢酵母原料指標(biāo)中核酸大分子率的限制，使原料的挑選范圍更廣，生產(chǎn)成本降低。同時(shí)由于采用了活性炭柱提純技術(shù)，活性炭吸附核苷酸的量極大，減少了酶及其他化學(xué)制劑對(duì)提純核苷酸的負(fù)面影響，使核苷酸成品的純度、色澤、溶解性及產(chǎn)量等各項(xiàng)性能指標(biāo)也得以大幅度提高。另外，本方法還充分利用了干酵母餅的細(xì)胞已部分破裂的特性，基本上不加鹽來提取核酸，因而脫核后的廢啤酒酵母口感不帶咸味，品質(zhì)較高，能滿足飼料酵母的標(biāo)準(zhǔn)，價(jià)格比鹽法提取核酸后的脫核酵母高。
以下是本發(fā)明所提出的從啤酒廢酵母中提取核苷酸的方法的一種具體實(shí)施例，該方法包括以下步驟1)核酸液的提取取經(jīng)滾筒干燥的啤酒廢酵母與8倍體積的水混合，攪拌成均勻的漿液，置于提取罐內(nèi)用濃度為6N的氫氧化納溶液調(diào)節(jié)其pH值至7.2～7.5。然后將此漿液加熱升溫至94～96℃，此時(shí)漿液發(fā)生反應(yīng)開始析出核酸，在此溫度下保持1.5～2小時(shí)，其間通過分光光度計(jì)取樣監(jiān)測(cè)漿液的OD260指標(biāo)，直至其不再升高后停止提取。再用換熱器將所提漿料的溫度降至20℃～30℃，并調(diào)節(jié)其pH值至4.8。最后利用D424高速離心機(jī)對(duì)此漿液進(jìn)行分離，分離出的清液即為含有核酸的提取液，將此核酸提取液升溫至80～90℃待用。
2)磷酸二酯酶酶液的制備利用中國科學(xué)院微生物研究所生產(chǎn)的標(biāo)號(hào)為AS3.2788的桔青霉菌種發(fā)酵生產(chǎn)的麩皮霉，重量為步驟1)所得核酸提取液中純核酸量的3倍，與10倍重量的水在45℃的溫度下浸泡1小時(shí)，然后降溫至20℃，用80目絲網(wǎng)濾除固體霉，再升溫使清液在70℃左右保持5分鐘后迅速降溫至30℃左右，隨后經(jīng)管式高速分離機(jī)去除孢子，所得清液即為磷酸二酯酶酶液。
3)混合酶解將步驟1)所得的核酸提取液和步驟2)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在70℃左右、pH值5.0～5.2的條件下水解2小時(shí)，再將其pH值調(diào)至7.2～7.4，并升溫至90℃左右，保持15分鐘后，迅速降溫至30℃左右，用板框過濾去除其中的不溶物，所得清液即為需要提純的核苷酸粗液。
4)活性炭柱提純將步驟3)所得核苷酸粗液的pH值調(diào)節(jié)至1.5后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分鐘0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完畢，然后以同樣的流速用軟水洗脫約6小時(shí)去雜，再以同樣的流速換用由50％的酒精和1％的氨水組成的洗脫液進(jìn)行洗脫，保持炭柱在60℃的恒溫下洗脫，直至流出液經(jīng)酒精檢測(cè)無白色渾濁為止，所得洗脫液即為濃度約為4％的核苷酸精液。保持此核苷酸精液的溫度為50℃，在真空條件下濃縮回收其中的酒精，使其中核苷酸的濃度提高至9～12％。再調(diào)節(jié)此高濃度核苷酸液的pH值至3.0，加入其體積量5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀，最后將此沉淀置于真空干燥柜內(nèi)烘干即得核苷酸成品。
權(quán)利要求
一種從啤酒廢酵母中提取核苷酸的方法，包括以下步驟1)核酸液的提取取干燥的啤酒廢酵母與6～10倍體積的水混合，攪拌成均勻的漿液，調(diào)節(jié)其pH值至7.2～7.5；然后將此漿液加熱升溫至94～96℃，保持1.5～2小時(shí)；再將其降溫至20℃～30℃，并調(diào)節(jié)其pH值至4.8～5.0；最后對(duì)此漿液進(jìn)行離心分離，分離出的清液即為含有核酸的提取液，將此核酸提取液升溫至80～90℃待用；
2)磷酸二酯酶酶液的制備取重量為步驟1)所得核酸提取液中純核酸量2.8～3.2倍的利用桔青霉菌種發(fā)酵生產(chǎn)的麩皮霉，與9～10倍重量的水在40～50℃的溫度下浸泡1～2小時(shí)，然后降溫至20～30℃，濾除固體霉，再升溫使清液在70℃左右保持4～6分鐘后迅速降溫至30℃左右，隨后去除孢子，所得清液即為磷酸二酯酶酶液；
3)混合酶解將步驟1)所得的核酸提取液和步驟2)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在65～75℃、pH值4.8～5.5的條件下水解1～2小時(shí)，再將其pH值調(diào)至7.2～7.8，并升溫至90℃左右，保持12～15分鐘后，迅速降溫至30～40℃，去除其中的不溶物，所得清液即為需要提純的核苷酸粗液；
4)活性炭柱提純將步驟3)所得核苷酸粗液的pH值調(diào)節(jié)至1.5～3.0后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分鐘0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完畢，然后以同樣的流速用軟水洗脫去雜，再以同樣的流速換用由40～60％的酒精和0.5～1％的氨水組成的洗脫液進(jìn)行洗脫，保持炭柱在50～70℃恒溫下洗脫，直至流出液經(jīng)酒精檢測(cè)無白色渾濁為止，所得洗脫液即為濃度約為3～5％的核苷酸精液；保持此核苷酸精液的溫度為50～70℃，在真空條件下濃縮回收其中的酒精，使其中核苷酸的濃度提高至9～12％；再調(diào)節(jié)此高濃度核苷酸液的pH值至2.5～3.5，加入其體積量3～5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀；將此沉淀真空干燥即得核苷酸成品。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種從啤酒廢酵母中提取核苷酸的方法。其步驟是先利用干燥的啤酒廢酵母細(xì)胞已部分破裂的特性,基本上不用鹽而將其中的核酸分解出來形成核酸液;然后不經(jīng)過核酸沉淀的中間步驟,而直接利用磷酸二酯酶酶液對(duì)所得核酸液進(jìn)行定向酶解,最后利用活性炭柱對(duì)所酶解的產(chǎn)物進(jìn)行提純而得到核苷酸成品。該方法具有工藝路線短、所提取的核苷酸產(chǎn)品得率高、純度好、成本低,性能穩(wěn)定等特點(diǎn),且脫核后的酵母是優(yōu)良的飼料,廢酵母利用率高。
文檔編號(hào)C12P19/00GKCN1370837SQ01106512
公開日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2001年2月27日
發(fā)明者郝全源, 鄭志明, 陳貽堃, 熊乾華, 王琪, 秦為民 申請(qǐng)人:武漢中鐵生物股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan