專(zhuān)利名稱：一種從啤酒廢酵母中提取海藻多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種海藻多糖提取制備的方法。
背景技術(shù)：
海藻糖是由兩個(gè)D-葡萄糖分子通過(guò)a-1，I糖苷鍵組成，其分子式為C12H22O11,相對(duì)分子質(zhì)量為378. 33，經(jīng)常以二水化合物存在。海藻糖為白色晶體，含有兩分子結(jié)晶水，熔點(diǎn)為97°C，當(dāng)加熱到130°C時(shí)，失去結(jié)晶水，無(wú)水海藻糖熔點(diǎn)達(dá)214-216°C。海藻糖甜味較弱，相當(dāng)于蔗糖甜度的45%，無(wú)毒性，能溶于水、冰醋酸和熱乙醇，不溶于乙醚、丙酮。海藻糖性質(zhì)十分穩(wěn)定，是天然雙糖中最穩(wěn)定的，無(wú)還原性，在食品中加熱不發(fā)生美拉德反應(yīng)，不被一般的酶水解，可被具有特異性的海藻糖酶水解為兩分子葡萄糖。海 藻糖是生物組織的非特異性天然保護(hù)劑，屬于非滲透性低溫保護(hù)劑，可使動(dòng)植物和微生物等有機(jī)體在冷凍、高溫、脫水、高滲透壓及有毒試劑等環(huán)境中仍然能保持生命活力。隨著研究的逐步深入，目前其已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域，有學(xué)者將其用于保存血小板、細(xì)胞、組織、器官，并取得了顯著的成果。由于海藻糖具有獨(dú)特的生物活性，各國(guó)科學(xué)家對(duì)其生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究。海藻糖的制備方法包括化學(xué)合成法、微生物提取法、微生物發(fā)酵法、酶合成法、基因工程法。海藻糖的化學(xué)合成法是在2，3，4，6-四乙酰基葡糖和3，4，6_三乙酰-1，2-脫水-D-葡糖之間產(chǎn)生環(huán)氧乙烷加成生成。該法制備海藻糖的缺點(diǎn)是產(chǎn)率低、分離困難，目前還處于研究階段。1950年Laura首先從酵母中提取海藻糖。微生物提取法是以酵母、乳酸菌、霉菌及其它含海藻糖的微生物為提取源，首先通過(guò)改變微生物的生長(zhǎng)條件，使其體內(nèi)積累更多的海藻糖，然后采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒑Ｔ逄翘崛〕鰜?lái)。微生物提取法是生產(chǎn)海藻糖的傳統(tǒng)方法，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)，此法已相當(dāng)成熟，至今仍然是生產(chǎn)海藻糖的常用方法。微生物提取法常采用酵母菌為原料，制備獲得的海藻多糖純度高，可用于醫(yī)藥、分子生物學(xué)試劑及食品領(lǐng)域。然而，微生物提取法生產(chǎn)海藻糖存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，提取率低，成本高，極大的限制了其規(guī)?；a(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)海藻糖是通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖，再?gòu)陌l(fā)酵液中提取純化。其關(guān)鍵是通過(guò)誘變、細(xì)胞融合及基因重組等方法選育高產(chǎn)海藻糖的菌株。如利用節(jié)桿菌屬、短莖細(xì)菌、棒桿菌屬、諾卡菌屬、絲核菌屬、微球菌屬等微生物的培養(yǎng)液來(lái)制備。然而，該法轉(zhuǎn)化率低，副產(chǎn)物多。酶合成法生產(chǎn)海藻多糖是以葡萄糖、麥芽糖或淀粉為底物，通過(guò)相應(yīng)的酶作用轉(zhuǎn)換成海藻糖。酶合成法生產(chǎn)海藻多糖，成本相對(duì)較低，但存在產(chǎn)品純度低，不合適醫(yī)藥、生物制劑等領(lǐng)域的應(yīng)用。在此背景下，本發(fā)明以啤酒酵母廢棄物為原料，完成海藻多糖的制備，為海藻多糖的微生物提取工藝的產(chǎn)業(yè)化推廣提供一定的技術(shù)支持。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種海藻多糖提取制備的方法，依此法可以有效提高海藻多糖的產(chǎn)量和產(chǎn)品純度，提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。I、發(fā)明技術(shù)方案一種海藻多糖提取制備的方法，主要通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(I)啤酒廢棄酵母預(yù)處理向啤酒廢酵母內(nèi)加入適量無(wú)菌水，過(guò)100目篩子進(jìn)行篩分，加入5%的酒石酸，攪拌后離心分離獲得純凈的啤酒酵母，備用。預(yù)處理獲得的純凈啤酒酵母98-105°C下烘干處理 40-48h。(2)索氏提取 烘干獲得啤酒酵母和無(wú)菌水一定比例混勻后放入索氏提取器內(nèi)，80_100°C，O. 09-0. IOMPa下完成索氏提取，提取結(jié)束后，提取液4°C下離心，取上清獲得海藻糖粗提液。(3)活性炭脫色調(diào)節(jié)提取液的pH值為8. 5-9. 0，控制溫度為45_50°C，按照2% _4%的百分比加入活性炭，浸提O. 5-2h，脫色次數(shù)為2-3次，至液體無(wú)色，離心留上清，備用。(4)堿金屬鹽沉淀除蛋白脫色液內(nèi)加入適量的硫酸鋅溶液，用加入Ba(OH)2調(diào)節(jié)pH值至8. 0，攪拌均勻，靜置后離心留上清，備用。(5)離子交換除雜將經(jīng)處理的大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂和大孔強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂柱按照用量體積比2 I混合裝柱，平衡后調(diào)節(jié)堿金屬鹽沉淀獲得溶液PH值后以2. OmL/min的流速進(jìn)行陰陽(yáng)離子交換除雜。(6)結(jié)晶干燥將經(jīng)離子交換除雜的流出液濃縮后，加入無(wú)水乙醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得海藻糖晶體。過(guò)濾獲得海藻糖晶體，用少量乙醇沖洗后，于40°C下真空干燥12h獲得海藻糖純品。2、發(fā)明技術(shù)特點(diǎn)(I)傳統(tǒng)微生物提取法生產(chǎn)海藻糖存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，提取率低，成本高，極大的限制了其規(guī)?；a(chǎn)，而本發(fā)明以啤酒廢棄酵母為原料進(jìn)行海藻糖的制備，可有實(shí)現(xiàn)廢棄物的再利用，同時(shí)還具有原料利用率高，成本低，工藝簡(jiǎn)單，方法易行、操作安全，且產(chǎn)品純度高，易于產(chǎn)業(yè)化推廣；(2)本發(fā)明采用索氏提取法進(jìn)行啤酒酵母內(nèi)海藻多糖的提取，同傳統(tǒng)的加熱回流方法相比，提取率可提高3倍以上；(3)本發(fā)明在海藻糖精制工藝中采用了堿金屬鹽沉淀工藝除蛋白，有效提高了海藻糖的純度，所獲得的產(chǎn)品純度達(dá)到98. 5%以上，可用于醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域。
四

圖I :啤酒廢酵母制備海藻糖工藝流程圖五具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一 稱取啤酒廢酵母1kg，加入IOL無(wú)菌水稀釋均勻后，過(guò)100目篩子篩分2次，加入酒石酸終濃度達(dá)到5%，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得純凈的啤酒酵母，備用。預(yù)處理獲得的純凈啤酒酵母放入烘箱內(nèi)，100°C烘干42h。烘干處理好的啤酒廢酵母用紗布包裹好放入索氏提取器內(nèi)，用25L去離子水，在80°C、真空度為O. 09MPa的條件下進(jìn)行索氏提取，提取結(jié)束后，提取液，4000r/min離心15min，取上清獲得海藻糖粗提液。調(diào)節(jié)海藻糖粗提液的pH值為8. 5，加入活性炭終濃度達(dá)到3 %，調(diào)節(jié)粗提液溫度為45°C進(jìn)行活性炭脫色，每次處理時(shí)間為lh，脫色次數(shù)為2次，至液體無(wú)色，離心留上清，備用。按照I : 100的體積比向脫色處理液內(nèi)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硫酸鋅溶液，攪拌均勻 后用Ba(OH)2調(diào)節(jié)溶液pH值至8. 0，靜置后離心留上清。將經(jīng)處理的大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂DOOl和大孔強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂柱D280按照用量體積比2 I混合裝柱，平衡后調(diào)節(jié)堿金屬鹽沉淀獲得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速進(jìn)行陰陽(yáng)離子交換除雜，流出液濃縮至40%后，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得海藻糖晶體。過(guò)濾獲得海藻糖晶體，用少量乙醇沖洗后，于40°C下真空干燥12h獲得海藻糖純品，HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度達(dá)到98. 6%。實(shí)施例二稱取啤酒廢酵母1kg，加入8L無(wú)菌水稀釋均勻后，過(guò)100目篩子篩分2次，加入酒石酸終濃度達(dá)到5%，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得純凈的啤酒酵母，備用。預(yù)處理獲得的純凈啤酒酵母放入烘箱內(nèi)，105°C烘干42h。烘干處理好的啤酒廢酵母用紗布包裹好放入索氏提取器內(nèi)，用25L去離子水，在80°C、真空度為O. 09MPa的條件下進(jìn)行索氏提取，提取結(jié)束后，提取液，4000r/min離心15min，取上清獲得海藻糖粗提液。調(diào)節(jié)海藻糖粗提液的pH值為9. O，加入活性炭終濃度達(dá)到2%，調(diào)節(jié)粗提液溫度為45°C進(jìn)行活性炭脫色，每次處理時(shí)間為O. 5h，脫色次數(shù)為2次，至液體無(wú)色，離心留上清，備用。按照I. 5 100的體積比向脫色處理液內(nèi)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的硫酸鋅溶液，攪拌均勻后用Ba(0!1)2調(diào)節(jié)溶液pH值至8. O，靜置后離心留上清。將經(jīng)處理的大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂D72和大孔強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂柱D296按照用量體積比2 I混合裝柱，平衡后調(diào)節(jié)堿金屬鹽沉淀獲得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速進(jìn)行陰陽(yáng)離子交換除雜，流出液濃縮至50%后，加入5倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得海藻糖晶體。過(guò)濾獲得海藻糖晶體，用少量乙醇沖洗后，于40°C下真空干燥12h獲得海藻糖純品，HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度達(dá)到98. 7%。實(shí)施例三稱取啤酒廢酵母1kg，加入IOL無(wú)菌水稀釋均勻后，過(guò)100目篩子篩分I次，加入酒石酸終濃度達(dá)到5%，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得純凈的啤酒酵母，備用。預(yù)處理獲得的純凈啤酒酵母放入烘箱內(nèi)，100°C烘干45h。烘干處理好的啤酒廢酵母用紗布包裹好放入索氏提取器內(nèi)，用25L去離子水，在80°C、真空度為O. 09MPa的條件下進(jìn)行索氏提取，提取結(jié)束后，提取液，4000r/min離心15min，取上清獲得海藻糖粗提液。
調(diào)節(jié)海藻糖粗提液的pH值為8. 5，加入活性炭終濃度達(dá)到4%，調(diào)節(jié)粗提液溫度為45°C進(jìn)行活性炭脫色，每次處理時(shí)間為lh，脫色次數(shù)為2次，至液體無(wú)色，離心留上清，備用。按照I : 100的體積比向脫色處理液內(nèi)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%的硫酸鋅溶液，攪拌均勻后用Ba(OH)2調(diào)節(jié)溶液pH值至8. 0，靜置后離心留上清。將經(jīng)處理的大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂D72和大孔強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂柱D280按照用量體積比2 I混合裝柱，平衡后調(diào)節(jié)堿金屬鹽沉淀獲得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速進(jìn)行陰陽(yáng)離子交換除雜，流出液濃縮至45%后，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得海藻糖晶體。過(guò)濾獲得海藻糖晶體，用少量乙醇沖洗后，于40°C下真空干燥12h獲得海藻糖純品，HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度達(dá)到98.6%。實(shí)施例四稱取啤酒廢酵母1kg，加入9L無(wú)菌水稀釋均勻后，過(guò)100目篩子篩分2次，加入酒石酸終濃度達(dá)到5%，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得純凈的啤酒酵母，備用。·預(yù)處理獲得的純凈啤酒酵母放入烘箱內(nèi)，98°C烘干48h。烘干處理好的啤酒廢酵母用紗布包裹好放入索氏提取器內(nèi)，用30L去離子水，在80°C、真空度為O. 09MPa的條件下進(jìn)行索氏提取，提取結(jié)束后，提取液，4000r/min離心15min，取上清獲得海藻糖粗提液。調(diào)節(jié)海藻糖粗提液的pH值為9. O，加入活性炭終濃度達(dá)到2 %，調(diào)節(jié)粗提液溫度為45°C進(jìn)行活性炭脫色，每次處理時(shí)間為lh，脫色次數(shù)為2次，至液體無(wú)色，離心留上清，備用。按照I. 2 100的體積比向脫色處理液內(nèi)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%的硫酸鋅溶液，攪拌均勻后用Ba(OH)2調(diào)節(jié)溶液pH值至8. O，靜置后離心留上清。將經(jīng)處理的大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂DOOlSC和大孔強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂柱D380按照用量體積比2 I混合裝柱，平衡后調(diào)節(jié)堿金屬鹽沉淀獲得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速進(jìn)行陰陽(yáng)離子交換除雜，流出液濃縮至40%后，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得海藻糖晶體。過(guò)濾獲得海藻糖晶體，用少量乙醇沖洗后，于40°C下真空干燥12h獲得海藻糖純品，HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度達(dá)到98. 8%。
權(quán)利要求
1.一種從啤酒廢酵母中提取海藻多糖的方法，其特征是以啤酒廢棄酵母為原料，經(jīng)預(yù)處理除雜、烘干滅酶、超聲波破碎后提取獲得海藻多糖粗提液后，采用超聲波破碎、索氏提取獲得海藻多糖的提取液，進(jìn)一步經(jīng)活性炭脫色、堿金屬鹽沉淀脫蛋白、離子交換除雜、濃縮、結(jié)晶干燥后獲得海藻多糖純品。
2.如權(quán)利要求I中所述的啤酒廢棄酵母預(yù)處理除雜，其特征在于向啤酒廢酵母內(nèi)加入無(wú)菌水，調(diào)節(jié)酵母懸液濃度為8% -10%，過(guò)100目篩子進(jìn)行篩分1-2次，加入5%的酒石酸，攪拌15-30min, 3000r/min離心分離獲得純凈的啤酒酵母,備用。
3.如權(quán)利要求I中所述的烘干處理，其特征在于預(yù)處理獲得的純凈啤酒酵母烘干處理過(guò)程中，烘干溫度為98-105°C，處理時(shí)間為40-48h。
4.如權(quán)利要求I中所述的索氏提取工藝，其特征在于烘干獲得啤酒酵母和無(wú)菌水的料液比I 25-1 30，提取溫度為80-1001，真空度0.09-0.1010^，提取結(jié)束后，提取液，4000r/min離心15min,取上清獲得海藻糖粗提液。
5.如權(quán)利要求I所述的活性炭脫色工藝中，其特征在于提取液的pH值為8.5-9.0，溫度為45-50°C，活性炭的添加量為2% -4%，提取時(shí)間為O. 5-2h，脫色次數(shù)為2_3次，至液體無(wú)色,離心留上清,備用。
6.如權(quán)利要求I所述的堿金屬鹽沉淀工藝，其特征在于加入的硫酸鋅溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-12%，添加比例為I 100-1.5 100。
7.如權(quán)利要求I所述的離子交換除雜工藝，其特征在于采用的強(qiáng)酸性大孔陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可選擇D001，001X7，D001SC, D72，強(qiáng)堿性打孔陰離子交換樹(shù)脂可選擇D280，D296，D201，D380中的一種，陰陽(yáng)樹(shù)脂用量體積比為2 1，混合裝柱，流速為2. OmL/min。
8.如權(quán)利要求I所述的結(jié)晶干燥工藝，其特征在于將經(jīng)離子交換除雜的流出液濃縮至40%-50%后，加入4-5倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得海藻糖晶體。過(guò)濾獲得海藻糖晶體，用少量乙醇沖洗后，于40°C下真空干燥12h獲得海藻糖純品O
9.如權(quán)利要求I所述的一種海藻多糖提取制備的方法，其特征在于制備獲得的海藻糖純度達(dá)到98. 5%以上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從啤酒廢酵母中提取海藻多糖的方法，屬于生物技術(shù)范疇。本方法利用啤酒廢酵母為原料進(jìn)行海藻多糖的制備，主要工藝為啤酒廢酵母預(yù)處理去雜后烘干滅酶，再采用索氏提取獲得海藻多糖提取液，進(jìn)一步經(jīng)活性炭脫色、堿金屬鹽沉淀脫蛋白、離子交換除雜、濃縮、結(jié)晶干燥后獲得海藻多糖，純度達(dá)到98.5％以上，可用于醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域。本發(fā)明具有原料利用率高、成本低、工藝簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全和產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H3/04GK102850410SQ20121036147
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者李少民 申請(qǐng)人:西藏金稞集團(tuán)有限責(zé)任公司