專利名稱:提高醋酸細(xì)菌溫度耐受性的基因、利用該基因培育的醋酸細(xì)菌以及利用該醋酸細(xì)菌生產(chǎn) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼源自微生物的具有提高溫度耐受性的蛋白質(zhì)的基因，一種該基因的拷貝數(shù)得到擴增的微生物，特別是一種屬于醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸細(xì)菌，以及一種通過利用這種微生物有效生產(chǎn)含有高濃度醋酸的醋的方法。
背景技術(shù)：
在醋的工業(yè)生產(chǎn)中，利用微生物進行醋酸發(fā)酵。這些微生物具有乙醇氧化能力并且一般稱為醋酸細(xì)菌。在醋酸細(xì)菌中，特別是屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸細(xì)菌被廣泛用作工業(yè)醋酸發(fā)酵。
在醋酸發(fā)酵中，培養(yǎng)基中的乙醇被被醋酸細(xì)菌氧化并且轉(zhuǎn)化為醋酸，結(jié)果，醋酸直接在培養(yǎng)基中積累。此時，產(chǎn)生大量的發(fā)酵熱，結(jié)果，當(dāng)不采取措施時發(fā)酵液中的溫度升高。對于醋酸細(xì)菌來說最佳的發(fā)酵溫度一般是30℃左右，所以，必須冷卻發(fā)酵液以便不升高其溫度，這導(dǎo)致需要能量進行冷卻。因此，在醋酸發(fā)酵中需要生長能力和發(fā)酵能力即使在較高的溫度下也不降低，即需要發(fā)展具有強溫度耐受性的醋酸細(xì)菌。作為一種手段已經(jīng)嘗試過通過從自然界中篩選具有溫度耐受性的醋酸細(xì)菌來尋找溫度耐受的醋酸細(xì)菌(見，例如，非專利文獻1)。
但是，很少發(fā)現(xiàn)對于醋酸細(xì)菌的溫度耐受基因，希望獲得一種編碼具有能夠在實踐水平上提高醋酸細(xì)菌溫度耐受性的功能的蛋白質(zhì)的基因并且利用獲得的溫度耐受基因培育具有較強溫度耐受性的醋酸細(xì)菌。
專利文獻1日本專利申請公開號60-9488專利文獻2日本專利申請?zhí)?003-350265非專利文獻1Agricultural and Biological Chemistry，44卷，2901-2906頁，1980非專利文獻2
Trends in Genetics，5卷，185-189頁，1989非專利文獻3Applied and Environmental Microbiology，55卷，171-176頁，1989非專利文獻4Agricultural and Biological Chemistry，52卷，3125-3129頁，1988非專利文獻5Agricultural and Biological Chemistry，49卷，2091-2097頁，1985非專利文獻6Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，58卷，974-975頁，1994非專利文獻7Cellulose，153-158頁，1989非專利文獻8Journal of Bacteriology，175卷，6857-6866頁，1993本發(fā)明要解決的技術(shù)問題如上所述，在此之前沒有在遺傳水平上闡明醋酸細(xì)菌的溫度耐受性并且成功開發(fā)具有高度溫度耐受性的實用性醋酸細(xì)菌的例子。但是，開發(fā)較高溫度耐受性的醋酸細(xì)菌將允許在比常規(guī)更高的溫度下進行醋酸發(fā)酵并且減少冷卻的成本。所以，本發(fā)明人再次嘗試在遺傳水平上闡明提高醋酸細(xì)菌的溫度耐受性。
作為從各方面考慮的結(jié)果，以及從這樣的觀點來看，即獲得一種編碼在實踐水平上具有提高溫度耐受性的功能的蛋白質(zhì)的新型溫度耐受基因，并且利用獲得的溫度耐受基因培育具有較強溫度耐受性的醋酸細(xì)菌是重要的，本發(fā)明人新近設(shè)定了新的技術(shù)任務(wù)以提供一種新基因來提高溫度耐受性，所述基因涉及溫度耐受性并且源自醋酸細(xì)菌的微生物，并且提供一種通過利用該基因提高微生物的溫度耐受性的方法，特別是一種提高屬于醋酸細(xì)菌的微生物的溫度耐受性的方法，進一步提供一種通過利用溫度耐受性得到提高的醋酸細(xì)菌來有效生產(chǎn)醋的方法。
本發(fā)明人假定一種不存在于其它微生物中的涉及溫度耐受性的特定基因存在于醋酸細(xì)菌中，所述醋酸細(xì)菌即使在高溫下也能夠生長和發(fā)酵，并且獲得一種新的觀念，即利用這種基因?qū)⒃试S比以往更有效地提高微生物的溫度耐受性并且開發(fā)出一種有效的生產(chǎn)方法。
作為獲得溫度耐受基因的常規(guī)方法，常用一種篩選溫度鈍性突變體的方法。
但是，考慮到通過這種方法發(fā)現(xiàn)一種工業(yè)上有用的溫度耐受基因是困難的，本發(fā)明了研究了其它獲得方法。結(jié)果，通過構(gòu)建醋酸細(xì)菌的染色體DNA文庫，用這種染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化醋酸細(xì)菌，篩選靶基因，發(fā)明人開發(fā)了一種獲得基因的方法，所述基因使得一般僅在37℃左右生長于瓊脂糖培養(yǎng)基上的醋酸細(xì)菌能夠在38℃的溫度下生長。
依照這種方法，本發(fā)明人首次成功克隆了編碼一種新的溫度耐受基因的DNA，所述溫度耐受基因來自實踐中用于生產(chǎn)醋中的葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸細(xì)菌，它具有在實踐水平上提高溫度耐受性的功能。
獲得的溫度耐受基因與一組在豆科植物細(xì)菌(leguminous bacteria)等中發(fā)現(xiàn)的稱為?；拾贝计咸寝D(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)顯示同源性，作為在DDBJ/EMBL/Genbank中同源性檢索的結(jié)果，推測它為一種編碼?；拾贝计咸寝D(zhuǎn)移酶的基因。
但是，獲得的醋酸細(xì)菌的?；拾贝计咸寝D(zhuǎn)移酶基因與在其它微生物如豆科植物細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的已知酰基鞘氨醇葡糖轉(zhuǎn)移酶基因具有極低的同源性。所以，盡管它與其它?；拾贝计咸寝D(zhuǎn)移酶基因在某種程度上相似，但獲得的基因為一種醋酸細(xì)菌特異的編碼一種新的蛋白質(zhì)(有時稱之為蛋白質(zhì)GCS)的新基因。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在乙醇存在時進行通風(fēng)培養(yǎng)的情況下，溫度耐受性顯著提高，最終的醋酸濃度可以顯著提高等等，并且進一步成功測定了蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼該蛋白質(zhì)的基因的DNA的核苷酸序列，由此完成本發(fā)明。
附圖簡述
圖1是顯示通過利用限制酶Sal和Kpn的源自克隆的Gluconacetobacter entanii的基因片段(pG1)的限制性酶切圖譜，GCS基因的定位以及pGCS和pGCS1的插入片段的示意圖。
圖2是顯示轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵時間過程的圖，其中GCS基因的拷貝數(shù)得到擴增。
圖3是顯示轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵時間過程的圖，其中GCS基因的拷貝數(shù)得到擴增。
圖4是顯示由GCS基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的圖。
圖5是顯示引物1的圖。
圖6是顯示引物2的圖。
圖7是顯示本發(fā)明的溫度耐受基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)的圖。
圖8是顯示pGI18的構(gòu)建的圖。
圖9是顯示pGI18的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)的圖。
圖10是顯示由圖9所示pGI18的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)的圖的續(xù)。
圖11是顯示由圖10所示pGI18的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)的圖的續(xù)。
圖12是顯示引物A的圖。
圖13是顯示引物B的圖。

發(fā)明內(nèi)容
即，本發(fā)明提供下列(1)到(10)作為實施方案的實施例。
(1)一種如下(A)或(B)所示的蛋白質(zhì)GCS(A)一種具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)一種由序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入、添加或倒位一個或幾個氨基酸所得的氨基酸序列組成的，并且具有提高溫度耐受性的功能的蛋白質(zhì)。
(2)一種編碼如下(A)或(B)所示的蛋白質(zhì)的新基因的DNA(A)一種具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)一種由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入、添加或倒位一個或幾個氨基酸所得的氨基酸序列組成的，并且具有提高溫度耐受性的功能的蛋白質(zhì)。
(3)上述(2)中所述基因的DNA，它是如下(a)或(b)所示的DNA(a)一種DNA，它包含由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的第73到1251位核苷酸組成的核苷酸序列，(b)一種DNA，它與包含由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的第73到1251位核苷酸組成的核苷酸序列的探針或其部分在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼一種具有提高溫度耐受性功能的蛋白質(zhì)。
(4)一種微生物，它的溫度耐受性通過擴增上述(2)或(3)中所述的DNA的細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)而得以提高。
(5)上述(4)中所述的微生物，其特征在于該微生物是一種屬于醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸細(xì)菌。
(6)一種生產(chǎn)醋的方法，其特征在于在含乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(4)或(5)中所述的微生物中的具有乙醇氧化能力的微生物，由此即使在高培養(yǎng)溫度下也能生產(chǎn)并在培養(yǎng)基中積累醋酸。
(7)一種重組質(zhì)粒pUCGCS(FERM BP-8217)，至少包括根據(jù)權(quán)利要求
(2)或(3)的DNA。
(8)一種重組質(zhì)粒pG1或pGCS，它通過分別將下述PCR擴增片段插入到例如醋酸細(xì)菌-大腸桿菌(Escherichia coil)穿梭質(zhì)粒pGI18(見，例如，專利文獻2)而不是如(7)中的大腸桿菌載體pT7Blue而獲得，所述PCR擴增片段包含至少一種具有在序列表SEQ.ID No.1中所示的核酸序列(SalI-KpnI片段)或其編碼區(qū)(第73到1251位核苷酸)。
(9)一種轉(zhuǎn)化子，它通過將重組質(zhì)粒pG1或pGCS導(dǎo)入醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)No.1023(FERM BP-2287)而獲得。
(10)一種轉(zhuǎn)化子，它通過將重組質(zhì)粒pG1或pGCS導(dǎo)入Acetobacteraltoacetigenes MH-24(FERM BP-491)而獲得。
根據(jù)本發(fā)明，對于一種微生物能夠提供和增強對溫度的耐受性。而且，在具有乙醇氧化能力的微生物中，特別是在醋酸細(xì)菌中，能夠明顯提高對溫度的耐受性并且能夠提供即使在高溫下也能有效積累醋酸的能力。
實施本發(fā)明的最佳方式下面，將對本發(fā)明進行詳細(xì)描述。
本發(fā)明的DNA本發(fā)明的DNA包含一種能夠種編碼具有提高溫度耐受性的功能并且含有如序列表SEQ.ID No.2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，它包含調(diào)節(jié)核酸序列的元件和該基因的結(jié)構(gòu)部分。更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及一種溫度耐受基因，該溫度耐受基因意為涉及溫度耐受性和/或提高溫度耐受性的基因。更具體地，該基因包含至少一種選自至少(i)具有序列表SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列的DNA和(ii)包括在(i)中的并且編碼GCS蛋白的基因(GCS基因)的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行制備。例如，這里在具體的核苷酸序列中所示的DNA可以通過，例如，使用醋酸細(xì)菌的染色體作為起始材料的鳥槍克隆進行制備。此時，根據(jù)其大小等將每個片段化的染色體DNA連接到適當(dāng)?shù)目寺≥d體如質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，并且通過合適的方法如電轉(zhuǎn)化將這種載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如醋酸細(xì)菌中，由此可以制備克隆每一個染色體DNA片段的克隆文庫。
另外，從這樣的克隆文庫中獲得的每個染色體DNA片段的核苷酸序列的測定可以按照例已知的方法如化學(xué)降解法(Maxam-Gilbert方法)或雙脫氧法來進行。
或者，本發(fā)明的DNA可以通過為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)合成或使用基于本發(fā)明DNA的核苷酸序列或本文所述的氨基酸序列信息的引物采用PCR方法進行擴增來制備。
例如，本發(fā)明的DNA可以如下從Gluconacetobacter entanii的染色體DNA中獲得。首先，獲得Gluconacetobacter entanii，例如Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株(FERMBP-491)的染色體DNA。染色體DNA可以通過例如日本專利申請公開號NO.60-9489公開的方法獲得。
其次，制備染色體DNA文庫以從獲得的染色體DNA中分離提高溫度耐受性的基因。開始，用合適的限制酶對染色體DNA進行部分消化以獲得各種染色體DNA片段混合物。對于限制酶，可以使用各種限制酶，并且酶切的程度可以通過根據(jù)所用的酶調(diào)節(jié)酶切反應(yīng)時間進行控制。例如，染色體DNA在溫度30℃或更高，優(yōu)選為37℃，在不同時間段(1分鐘到2小時)以1到10單位/ml的酶濃度通過Sau3AI的作用進行消化。同時，在下面提到的例子中使用SalI和KpnI。
隨后，將染色體DNA的消化片段連接到能夠在醋酸細(xì)菌中自主復(fù)制的載體DNA上。具體地，在37℃的溫度和1-100單位/ml的酶濃度下通過限制酶的作用將該載體DNA完全消化1小時或更長，它產(chǎn)生與用于消化染色體DNA的限制酶，如SalI和KpnI互補的末端核苷酸序列。
將消化的載體DNA與染色體DNA片段混合物相混合，隨后通過T4DNA連接酶的作用可以獲得目標(biāo)重組DNA(DNA文庫)。偶而，T4DNA連接酶作用的條件可以設(shè)定于，例如，4-16℃的溫度和1-100單位/ml的酶濃度持續(xù)1小時或更長，優(yōu)選6到24小時。
利用獲得的重組DNA，轉(zhuǎn)化一種通常只能在37℃生長于瓊脂糖培養(yǎng)基上的醋酸細(xì)菌No.1023(FERM BP-2287)并且在38℃進行培養(yǎng)。將形成的菌落接種到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，隨后從獲得的細(xì)菌細(xì)胞中回收質(zhì)粒，可以獲得一種包括溫度耐受基因的DNA片段。
關(guān)于本發(fā)明的DNA，具體例示包含序列表SEQ ID No.1中所示核苷酸序列的DNA，其中該核苷酸序列中第73-1251位核苷酸所組成的核苷酸序列是編碼區(qū)。
作為在DDBJ/EMBL/Genbank和SWISS-PROT/PIR上關(guān)于SEQ IDNo.1中所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列(圖4對應(yīng)于第73-1251位核苷酸)的同源性檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它們在氨基酸水平顯示與Mesorhizobium loti的神經(jīng)酰胺糖基轉(zhuǎn)移酶基因有41％的同源性并且與根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的神經(jīng)酰胺糖基轉(zhuǎn)移酶基因有39％的同源性，但是每個同源性都是低的(40％左右)，所以，顯然這是一種新基因并且不同于編碼這些蛋白質(zhì)的基因。此外，完全不知道上面提及的神經(jīng)酰胺糖基轉(zhuǎn)移酶基因涉及溫度耐受性。
本發(fā)明的DNA的核苷酸序列，例如，本發(fā)明的DNA還可以通過利用醋酸細(xì)菌的基因組DNA作為模板，在該核苷酸序列基因基礎(chǔ)上合成的寡核苷酸作為引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))，或通過在該核苷酸基礎(chǔ)上合成的寡核苷酸作為探針進行雜交等來獲得。
關(guān)于寡核苷酸的合成，它可以例如利用商業(yè)上現(xiàn)有的各種DNA合成儀以常規(guī)方式進行合成。此外，可以利用Applied Biosystems生產(chǎn)的熱循環(huán)儀基因擴增PCR系統(tǒng)9700和Taq DNA聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn)生產(chǎn))、KOD-Plus(東洋紡織公司生產(chǎn))等以常規(guī)方式進行PCR反應(yīng)。
關(guān)于編碼具有提高溫度耐受性功能的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA，它可以是一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，在所述蛋白質(zhì)中于一個或幾個位點上缺失、取代、插入或添加了一個或幾個氨基酸，只要編碼蛋白質(zhì)的提高溫度耐受性的功能不受損害。
編碼一種與這種具有提高溫度耐受性功能的蛋白質(zhì)基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA還可以例如利用位點特異性誘變劑通過定點突變使特定位點上的氨基酸序列缺失、取代、插入、添加或反轉(zhuǎn)而獲得。另外，如上所述的修飾DNA還可以通過常規(guī)的突變處理來獲得。
此外，由于通常已知一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列或編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列在物種、株系、突變體和變異體之間稍微不同，所以編碼基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以從一般的醋酸細(xì)菌，特別是從醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的物種、株系、突變體和變異體中獲得。
具體地，編碼一種與該蛋白質(zhì)基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以從屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸細(xì)菌、進行突變處理的屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸細(xì)菌，或其天然突變體或變異體中，通過例如，分離DNA來獲得，所述DNA在嚴(yán)格條件下與包含由序列表SEQ ID No.1中所示核苷酸序列內(nèi)的第73-1251位核苷酸所組成的核苷酸序列雜交并且編碼一種具有提高溫度耐受性功能的蛋白質(zhì)。
所謂嚴(yán)格條件是這樣一種條件，即在該條件下形成所謂的特異性雜交而不形成非特異性雜交。盡管難于清楚地量化這種條件，但如果要舉例子的話，例如這樣一種條件，在該條件下具有高度同源性的DNA，例如具有70％或更高同源性的DNA雜交，而具有低于此的同源性的DNA不雜交，或這樣一種條件，在該條件下進行雜交作用的一般性洗滌，例如洗滌在等同于60℃上1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下進行。
具有提高溫度耐受性的功能的確認(rèn)可以通過，例如，如下面提及的實施例中所說明的用一種靶DNA轉(zhuǎn)化醋化醋桿菌No.1023菌株(FERMBP-2287)并且研究它是否能夠在38℃生長來進行，所述菌株一般僅在37℃左右生長于瓊脂糖培養(yǎng)基上。
(2)本發(fā)明的醋酸細(xì)菌本發(fā)明的醋酸細(xì)菌為屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸細(xì)菌，或者是溫度耐受性得到提高的這類屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的細(xì)菌。
關(guān)于屬于醋酸桿菌屬的細(xì)菌，可以具體地舉例醋化醋桿菌，例如，醋化醋桿菌No.1023菌株(保藏為FERM BP-2287，國際專利生物保藏機構(gòu))、醋化醋桿菌木亞種(Acetobacter aceti subsp.xylimum)IFO 3288和醋化醋桿菌IFO 3283菌株。
另外，對于屬于葡糖酸醋酸桿菌屬的細(xì)菌，例如，可以舉例歐洲葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter europaeus)DSM6160和Gluconacetobacterentanii，以及例如Acetobacter altoacetigene MH-24菌株(保藏為FERMBP-491，國際專利生物保藏機構(gòu))。
溫度耐受性可以，例如，通過擴增溫度耐受基因的細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)，或通過利用重組DNA轉(zhuǎn)化屬于醋酸桿菌屬的細(xì)菌而得以提高，所述重組DNA是通過將含有該基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段連接到一種在屬于醋酸桿菌屬的細(xì)菌中有效作用的啟動子序列上來獲得的。
此外，溫度耐受性還可以通過用其它在屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的細(xì)菌中有效作用的啟動子序列，例如來自醋酸細(xì)菌的乙醇脫氫酶(例如，見非專利文獻8)的啟動子序列或源自醋酸細(xì)菌之外的微生物的啟動子序列，包括如質(zhì)粒pBR322的抗氨芐青霉素基因、質(zhì)粒pACYC177的抗卡那霉素基因、質(zhì)粒pACYC184的抗氯霉素基因、來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因的啟動子代替染色體DNA上基因的啟動子序列而得以提高。
細(xì)胞內(nèi)基因的拷貝數(shù)增加可以通過將保有該基因的多拷貝載體導(dǎo)入屬于醋酸桿菌的細(xì)菌的細(xì)胞中進行，即，它可以通過將一種保持該基因的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等導(dǎo)入屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的細(xì)菌的細(xì)胞中而進行。
關(guān)于多拷貝載體，例如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等。關(guān)于質(zhì)粒，例如pMV24(例如，見非專利文獻3)、pGI18(例如，見非專利文獻2)、pUF106(例如，見非專利文獻7)、pTA5001(A)、pTA5001(B)(例如，見非專利文獻1)等，再例如一種染色體整合型載體pMVL1(例如，見非專利文獻4)。另外，關(guān)于轉(zhuǎn)座子，例如Mu，IS1452等。
將DNA導(dǎo)入屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸細(xì)菌中可以通過氯化鈣法(例如，見非專利文獻5)、電轉(zhuǎn)化法(例如，見非專利文獻6)等來進行。
以上述方式提高屬于具有乙醇氧化能力的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸細(xì)菌中的溫度耐受性能夠提高醋酸的生產(chǎn)效率。
(3)生產(chǎn)醋的方法本發(fā)明的生產(chǎn)醋的方法，其特征為培養(yǎng)微生物，由此生產(chǎn)并在培養(yǎng)基中積累醋酸，所述微生物是通過擴增溫度耐受基因的拷貝數(shù)選擇性提高其溫度耐受性的屬于醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中具有乙醇氧化能力。
可以用與常規(guī)的醋酸細(xì)菌發(fā)酵方法相同的方式實施該方法。含有乙醇的培養(yǎng)基意為含有醇如乙醇、碳源、氮源、無機物質(zhì)等的培養(yǎng)基，可以使用具有與在所謂醋酸發(fā)酵中所用的培養(yǎng)基相似組分的培養(yǎng)基。它可以是合成的培養(yǎng)基或天然的培養(yǎng)基，只要它含有所用細(xì)菌菌株生長所需的適量營養(yǎng)。關(guān)于碳源，可以使用各種糖類如葡萄糖和蔗糖以及各種有機酸。關(guān)于氮源，可以使用天然氮源如胨、發(fā)酵細(xì)菌的降解產(chǎn)物等。
此外，可以根據(jù)通常的方法如在靜態(tài)培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)和在好氧條件下的通氣攪動培養(yǎng)來進行。培養(yǎng)溫度是20-40℃，優(yōu)選25-35℃，一般設(shè)定為30℃。培養(yǎng)基的pH一般在2.5到7.0范圍之內(nèi)，優(yōu)選在2.7到6.5范圍之內(nèi)，它可以用各種酸、堿、緩沖液等根據(jù)需要進行調(diào)節(jié)。
如上所述，在本發(fā)明中，通過在含有乙醇的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可以在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累醋酸。通常，通過1到21天的培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中以較高濃度生產(chǎn)和積累醋酸。
(4)本發(fā)明的實施方案已把將根據(jù)本發(fā)明的ORF(SEQ ID No.1中的第73-1251位核苷酸)或包含該ORF的溫度耐受基因(SEQ ID No.1)的一部分插入到大腸桿菌載體(多拷貝載體)pT7Blue(Novagen Co.生產(chǎn))而制得的重組質(zhì)粒pUCGCS保藏為FERM BP-8217國際專利生物保藏單位，從而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地獲得根據(jù)本發(fā)明的DNA，并實施本發(fā)明。此外，如果需要，利用這種重組質(zhì)粒，將根據(jù)本發(fā)明的ORF或含有該ORF的溫度耐受基因遞送到一種能夠在醋酸細(xì)菌中自主復(fù)制的載體中，將該載體導(dǎo)入醋酸細(xì)菌中并且培養(yǎng)該醋酸細(xì)菌，由此即使在高溫條件下也可以進行醋酸發(fā)酵并且可以降低冷卻成本。
另外，如上所述和下述實施例闡明了提高溫度耐受性的基因來源的保藏、該基因的核苷酸序列、對應(yīng)于該基因的蛋白質(zhì)的氨基酸序列、PCR的實施方案、質(zhì)粒載體和重組載體的制備、宿主細(xì)菌的保藏等，它們的每一種都可以輕易地獲得、操作和處理，所以如果參考實施例進行每種操作和處理，就可以獲得目標(biāo)溫度耐受性轉(zhuǎn)化子。使用該轉(zhuǎn)化子即使在高溫條件下也能夠生產(chǎn)醋酸。
下面，將參考實施例對本發(fā)明作更加具體地解釋。
實施例(實施例1)從Gluconacetobacter entanii中克隆溫度耐受基因并且測定核苷酸序列和氨基酸序列染色體DNA文庫的產(chǎn)生將Gluconacetobacter entanii的一種菌株，Acetobacter altoacetigenesMH-24菌株(FERM BP-491)，在添加了6％的醋酸和4％乙醇的YPG培養(yǎng)基中(包含3％葡萄糖，0.5％酵母提取物和0.2％蛋白胨)于30℃搖動培養(yǎng)240-336小時。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基離心(7,500g，10分鐘)獲得細(xì)菌細(xì)胞。通過日本專利申請No.60-9489中公開的方法從獲得的細(xì)菌細(xì)胞中制備染色體DNA。
用限制酶SalI和KpnI(Takara Bio Inc生產(chǎn))消化上述獲得的染色體DNA和大腸桿菌-醋酸細(xì)菌穿梭載體(pMV24)。將這些DNA足量地混合并利用連接試劑盒(Takara DNA連接試劑盒Ver.2，Takara BioInc生產(chǎn))進行連接，由此構(gòu)建Acetobacter altoacetigens MH-24的染色體DNA文庫。
(2)溫度耐受基因的克隆以用上述方式獲得的Acetobacter altoacetigenes MH-24的染色體DNA文庫，轉(zhuǎn)化通常只能在最高37℃左右的生長溫度生長于瓊脂培養(yǎng)基上的醋化醋桿菌No.1023菌株(FERM BP-2287)。隨后將轉(zhuǎn)化的醋化醋桿菌No.1023菌株在添加了100μg/ml氨芐青霉素的YPG瓊脂培養(yǎng)基上于38℃培養(yǎng)4天。
隨后，將形成的菌落接種入包含100μg/ml氨芐青霉素的YPG培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)，從獲得的細(xì)菌細(xì)胞中收回質(zhì)粒。結(jié)果，可以回收質(zhì)粒，在所述質(zhì)粒中克隆了如圖1中所示的大約1.6kb的SalI-KpnI片段，這種質(zhì)粒稱為pG1。
以這種方式，獲得了提高溫度耐受性的DNA，它使得通常只能在最高37℃左右生長于瓊脂培養(yǎng)基上的醋化醋桿菌No.1023菌株即使在38℃也能生長。
(3)克隆DNA片段的核苷酸序列和氨基酸序列的測定將上述描述的克隆SalI-KpnI片段插入pUC19的SalI-KpnI酶切位點，用Sanger的雙脫氧鏈終止法測定該片段的核苷酸序列。在DNA雙鏈的所有區(qū)域都進行核苷酸序列的測定，并且以酶切位點重疊的方式進行核苷酸序列的測定。
結(jié)果，測定了在序列表SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列。在序列表SEQ.ID No.1所示核苷酸序列的第73-1251位核苷酸中，確認(rèn)了編碼由序列表SEQ.ID No.2所示的393個氨基酸所組成的的氨基酸序列的開放閱讀框(ORF)的存在。
(實施例2)用來自Gluconacetobacter entanii的溫度耐受基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子溫度耐受性的提高(1)醋化醋桿菌的轉(zhuǎn)化使用KOD-Plus(東洋紡織公司生產(chǎn))通過PCR方法擴增如上述實施例1中克隆的源自Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的提高溫度耐受的基因。隨后，通過將擴增片段插入到醋酸細(xì)菌-大腸桿菌穿梭載體pMV24(例如，見非專利文獻3)的限制酶Sma I酶切位點構(gòu)建pGCS。插入到pGCS中的擴增片段的概要圖顯示于圖1。該擴增片段包括在SalI-KpnI片段中(提高溫度耐受的基因，其核苷酸序列顯示于SEQ.ID No.1中)，并且包括第73-1251位核苷酸的編碼區(qū)(ORF)的上游和下游區(qū)的部分。
如下實施PCR方法；即，利用源自上述醋酸細(xì)菌作為模板并且利用引物1(其核苷酸序列顯示于SEQ ID No.3(圖5)中)和引物2(其核苷酸序列顯示于SEQ ID No.4(圖6)中)在下列條件下實施PCR方法。
(PCR條件)該PCR方法進行30個循環(huán)，一個循環(huán)由94℃15秒、60℃30秒和68℃2分鐘所組成。
通過電轉(zhuǎn)化方法(例如，見非專利文獻6)用這種pGCS轉(zhuǎn)化醋化醋桿菌No.1023(FERM BP-2287)。通過將其在加入100μg/ml的氨芐青霉素的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基上于38℃的培養(yǎng)溫度進行培養(yǎng)來篩選轉(zhuǎn)化子。
通過以常規(guī)的方式從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒并且對它進行分析，確定生長于選擇性培養(yǎng)基上的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子保有具有溫度耐受基因(GCS基因)的質(zhì)粒。
實施例(3)用源自Gluconacetobacter entanii的溫度耐受基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵測試(1)轉(zhuǎn)化子的溫度耐受性將實施例2中獲得的具有質(zhì)粒pGCS的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子與只導(dǎo)入穿梭載體pMV24的醋化醋桿菌No.1023的起始菌株就培養(yǎng)溫度改變時在YPG培養(yǎng)基中的生長情況進行了比較。
具體地，使用2L的微小發(fā)酵罐(Mitsuwa Rikagake KogyoCo.；KMG-2A)在1L包含1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml氨芐青霉素的1LYPG培養(yǎng)基中于400rpm和0.2vvm進行通氣-振蕩培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)基中醋酸的濃度和轉(zhuǎn)化子的生長(通過測量660nm下的吸收值)與起始菌株進行比較。開始培養(yǎng)溫度為30℃，隨后發(fā)酵在33℃進行，直到醋酸濃度達到約3％。隨后溫度進一步升至36℃，并且進行發(fā)酵直到醋酸濃度達到3％。其后，溫度以2℃的增量上升，進行醋酸發(fā)酵。當(dāng)醋酸濃度達到3％時，除了留在微小發(fā)酵罐中的100ml培養(yǎng)基外，去除其余的培養(yǎng)基。向剩余的100ml培養(yǎng)基中加入900mlYPG培養(yǎng)基，所述加入是以這樣一種方式來進行的，即醋酸、乙醇和氨芐青霉素的終濃度分別為1％、4％和100μg/ml，并且以上述方式來改變溫度，重新開始醋酸發(fā)酵。
結(jié)果，如圖2中顯示，盡管在醋化醋桿菌No.1023菌株的起始菌株中，細(xì)菌的生長和醋酸發(fā)酵僅僅能夠確認(rèn)為最高37℃，但是在轉(zhuǎn)化子中，細(xì)菌的生長和醋酸發(fā)酵即使在38℃也是可能的，而且，獲得了甚至在40℃也可確認(rèn)生長的結(jié)果，由此GCS基因的提高溫度耐受性的功能得以確認(rèn)。
(實施例4)用源自Gluconacetobacter entanii的溫度耐受基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子溫度耐受性的提高(1)醋化醋桿菌的轉(zhuǎn)化使用KOD-Plus(東洋紡織公司生產(chǎn))通過PCR方法擴增如上述實施例1中克隆的源自Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的提高溫度耐受的基因。隨后，插入到醋酸細(xì)菌-大腸桿菌穿梭載體pGI18(例如，見非專利文獻2)限制酶Sma I的酶切位點來構(gòu)建pGCS1。插入到pGCS1的擴增片段的概要顯示于圖1中。該擴增片段包括在SalI-KpnI片段中(提高溫度耐受的基因，其核苷酸序列顯示在SEQ.ID No.1中)，并且包括第73-1251位核苷酸的編碼區(qū)(ORF)的上游和下游區(qū)的部分。
如下實施PCR方法；即，利用源自醋酸細(xì)菌的上述基因組DNA作為模板并且利用引物1(其核苷酸序列顯示于SEQ ID No.3(圖5)中)和引物2(其核苷酸序列顯示于SEQ ID No.4(圖6)中)在下列條件下實施PCR方法。
(PCR條件)實施PCR方法30個循環(huán)，一個循環(huán)由94℃15秒、60℃30秒和68℃2分鐘所組成。
通過電轉(zhuǎn)化方法(例如，見非專利文獻6)用pGCS1轉(zhuǎn)化醋化醋桿菌No.1023(FERM BP-2287)。通過將其在加入100μg/ml的氨芐青霉素的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基上于38℃的培養(yǎng)溫度進行培養(yǎng)來篩選轉(zhuǎn)化子。
通過以常規(guī)的方式從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒并且對它進行分析，確定生長于選擇性培養(yǎng)基上的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子保有具有溫度耐受基因(GCS基因)的質(zhì)粒。
通過圖8所示的方法構(gòu)建醋酸細(xì)菌的載體pGI18。
這一載體pGI18是由質(zhì)粒pGI1和pUC18構(gòu)建而來。首先，構(gòu)建質(zhì)粒pGI1。
即，將Gluconacetobacter entanii的一個菌株Acetobacter altoacetigenesMH-24菌株(FERM BP-491)，在添加了6％醋酸和4％乙醇的YPG培養(yǎng)基(包含3％葡萄糖、0.5％酵母提取物和0.2％蛋白胨)中30℃搖動240小時到336小時進行培養(yǎng)。獲得的細(xì)菌細(xì)胞用氫氧化鈉或十二烷基硫酸鈉進行酶切，然后用苯酚并且進一步用乙醇處理，由此對質(zhì)粒DNA進行純化。
用不同的限制酶消化獲得的質(zhì)粒DNA(Takara Bio Inc生產(chǎn))(37℃和1單位/ml的酶濃度)，并且通過瓊脂糖電泳來測定獲得的DNA片段的堿基對大小。
獲得的質(zhì)粒DNA是一種由具有三個Hinc II識別位點和一個Sfi I識別位點的環(huán)狀雙鏈DNA所組成的質(zhì)粒，該質(zhì)粒的整體大小約為3100bp。此外，它沒有EcoRI、Sal、KpnI、SmaI、BamHI、XbaI、SalI、PstI、SphI和HindIII的識別位點。獲得的質(zhì)粒DNA命名為質(zhì)粒pGI1并且用于載體pGI18的構(gòu)建(圖8)。
使用KOD-Plus(YOYOBO Co.，LTD)以PCR方法對上面獲得的質(zhì)粒pGI1進行擴增，并且使用AatII進行消化。
如下實施PCR方法；即，利用實施例1中制備的質(zhì)粒pGI1作為模板并且利用具有AatII識別位點的引物A和引物B作為引物在下列條件下實施PCR方法。引物A和引物B的核苷酸序列分別在SEQ.ID No.6(圖12)和SEQ.ID No.7(圖13)中顯示。
PCR條件為30個循環(huán)，一個循環(huán)由94℃30秒、60℃30秒和68℃3分鐘所組成。
另一方面，以AatII消化(于37℃和1單位/ml的酶濃度)具有氨芐青霉素(Amp)-抗性基因(寶酒造公司生產(chǎn)生產(chǎn)2686bp)的pUC18，并且用T4DNA連接酶連接到質(zhì)粒pGI1上。隨后，在連接后使用反應(yīng)溶液以常規(guī)方式轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(寶酒造公司生產(chǎn)生產(chǎn))，并且通過在包含100μg/ml氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基(10g胨、5g酵母膏提取物和5gNacl)上進行選擇來獲得具有Amp抗性的轉(zhuǎn)化子。從獲得的轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒，并且對其限制酶酶切方式進行分析。在圖8中，顯示了獲得質(zhì)粒的限制酶圖譜。在圖8中，“AatII”和“SfiI”表示限制酶識別位點。此外，MCS表示多克隆位點，Ampr表示氨芐青霉素抗性基因位點，括號中的數(shù)字表示bp單位所代表的核苷酸組分的數(shù)目。另外，中間的“pUC18”、“pGI1”和“pGI18”表示質(zhì)粒的名字，而“2.7kbp”、“3.1kbp”和“5.8kbp”表示質(zhì)粒的總堿基數(shù)。
由圖8顯而易見，獲得的質(zhì)粒包含pUC18和pGI1二者，并且其總的大小為約5800bp(5.8kbp)。醋酸細(xì)菌的這個質(zhì)粒命名為pGI18。
該載體pGI18的核苷酸序列顯示在SEQ.ID No.5(圖9、圖10和圖11)中。
(2)轉(zhuǎn)化子的溫度耐受性將以上述方式獲得的具有質(zhì)粒pGCS的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子與只導(dǎo)入穿梭載體pGI18的醋化醋桿菌No.1023的起始菌株就培養(yǎng)溫度改變時在YPG培養(yǎng)基中的生長情況進行了比較。
具體地，使用2L的微小發(fā)酵罐(Mitsuwa Rikagake KogyoCo.；KMG-2A)在1L包含1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml氨芐青霉素的1LYPG培養(yǎng)基中于400rpm和0.2vvm進行通氣-振蕩培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)基中醋酸的濃度和轉(zhuǎn)化子的生長(通過測量660nm下的吸收值)與起始菌株進行比較。開始培養(yǎng)溫度為30℃，隨后發(fā)酵在33℃進行，直到醋酸濃度達到約3％。隨后溫度進一步升至36℃，并且進行發(fā)酵直到醋酸濃度達到3％。其后，溫度以2℃的增量上升，進行醋酸發(fā)酵。當(dāng)醋酸濃度達到3％時，除了留在微小發(fā)酵罐中的100ml培養(yǎng)基外，去除其余的培養(yǎng)基。向剩余的100ml培養(yǎng)基中加入900mlYPG培養(yǎng)基，所述加入是以這樣一種方式來進行的，即醋酸、乙醇和氨芐青霉素的終濃度分別為1％、4％和100μg/ml，并且以上述方式來改變溫度，重新開始醋酸發(fā)酵。
結(jié)果，如圖3中顯示，盡管在醋化醋桿菌No.1023菌株的起始菌株中，細(xì)菌的生長和醋酸發(fā)酵僅僅能夠確認(rèn)為最高37℃，但是在轉(zhuǎn)化子中，細(xì)菌的生長和醋酸發(fā)酵即使在38℃也是可能的，而且，獲得了甚至在40℃也可確認(rèn)生長的結(jié)果，由此GCS基因的提高溫度耐受性的功能得以確認(rèn)。
實施例(5)用源自Gluconacetobacter entanii的溫度耐受基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵測試(1)Acetobacter altoacetigenes的轉(zhuǎn)化通過電轉(zhuǎn)化方法(例如，見非專利文獻6)用如在實施例4中獲得的質(zhì)粒pGCS1轉(zhuǎn)化Gluconacetobacter entanii的一種菌株Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)。用含有0.55％瓊脂糖的加入100μg/ml氨芐青霉素、4％的醋酸和4％的乙醇的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基來選擇轉(zhuǎn)化子。
通過以常規(guī)的方式從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒并且對它進行分析，確定生長于選擇性培養(yǎng)基上的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子保有具有提高溫度耐受性的基因的質(zhì)粒。
(2)醋酸發(fā)酵測試在醋酸發(fā)酵能力方面，將具有在(1)中獲得的質(zhì)粒pGCS1的抗氨芐青霉素轉(zhuǎn)化子與僅導(dǎo)入了穿梭質(zhì)粒pGI18的AcetobacteraltoacetigenesMH-24起始菌株進行比較。
具體地，使用5L的微小發(fā)酵罐(Mitsuwa Rikagaku Kogyo Co.；KMJ-5A)在2.5L的含有100μg/ml氨芐青霉素的原材料培養(yǎng)基中(7％醋酸，3％乙醇，0.2％酵母提取物和0.2％的葡萄糖)于30℃，500rpm和0.20vvm進行通氣-振蕩培養(yǎng)。當(dāng)確認(rèn)了細(xì)菌的明顯生長并且剩余的乙醇濃度達到2％時，加入含有乙醇的溶液(1％的醋酸，50％的乙醇，0.2的酵母提取物和0.2％的葡萄糖)，由此將發(fā)酵液中的乙醇濃度保持在2％。通過這種醋酸發(fā)酵方法，將轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵能力與起始菌株的能力相比較。結(jié)果總結(jié)于表1中。
(表1)




從表1的結(jié)果，確定了轉(zhuǎn)化子在最終醋酸濃度上顯著占優(yōu)。
(3)醋化醋桿菌木亞種的轉(zhuǎn)化通過電轉(zhuǎn)化方法(例如，見非專利文獻6)用如在實施例4中獲得的質(zhì)粒pGCS1轉(zhuǎn)化醋化醋桿菌木亞種的一種菌株醋化醋桿菌木亞種IFO3288菌株。用加入100μg/ml的氨芐青霉素的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基來選擇轉(zhuǎn)化子。
通過以常規(guī)的方式從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒并且對它進行分析，確定生長于選擇性培養(yǎng)基上的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子保有具有提高溫度耐受性的基因的質(zhì)粒。
(4)醋酸發(fā)酵測試在醋酸發(fā)酵能力方面，將具有在(3)中獲得的質(zhì)粒pGCS1的抗氨芐青霉素轉(zhuǎn)化子與僅導(dǎo)入了穿梭質(zhì)粒pGI18的醋化醋桿菌木亞種IFO3288菌株的起始菌株相比較。
具體地，在5L的微小發(fā)酵罐(Mitsuwa Rikagaku Kogyo Co.；KMJ-5A)中使用一種原材料培養(yǎng)基中于30℃，500rpm和0.20vvm進行通氣-振蕩培養(yǎng)，在7.2％醋酸濃度連續(xù)發(fā)酵，所述原材料培養(yǎng)基是通過以這樣的比率(乙醇的濃度7.8％，醋酸的濃度0.26％)混合17.9％糖化的大米溶液、3.2％發(fā)酵的moromi、用于釀造的7.8％乙醇和71.1％的水制備的。比較于7.2％醋酸濃度上的連續(xù)發(fā)酵中添加培養(yǎng)基的速率，結(jié)果顯示于表2中。此外，于7.2％醋酸濃度上的連續(xù)發(fā)酵中當(dāng)對于轉(zhuǎn)化子與起始菌株的原材料添加速率一致時比較醋酸發(fā)酵能力。結(jié)果顯示于表3中。
(表2)


(表3)




從表2和表3的結(jié)果，確認(rèn)了在連續(xù)的醋酸發(fā)酵中，轉(zhuǎn)化子在生產(chǎn)率(原材料培養(yǎng)基添加速率)和生產(chǎn)醋酸的濃度上也是顯著占優(yōu)的。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種涉及溫度耐受性的新基因，另外通過利用該基因可以獲得一種在較高溫度條件下能夠高效生產(chǎn)醋酸的培育菌株，并且利用該培育菌株可以提供在較高溫度條件下高效生產(chǎn)醋酸的方法。
序列表<110>Mitsukan Group Corporation<120>提高醋酸細(xì)菌溫度耐受性的基因、利用該基因培育的醋酸細(xì)菌以及利用該醋酸細(xì)菌生產(chǎn)醋的方法<130>
<141>2003-12-04<160>7<210>1<211>1313<212>DNA<213>Glucoracetobacter entanii<400>1gaagagtgat attacacttc cctgacgccg ttttctaatt tgctccatac gcgggacctt 60gccggaaaga taatgtctgt tttcaacgct cttgtttcac ccgccggact ggccgcgacc 120gttgcggtcg ccgggtgcat gcaggcagcg cttggcactt ttctggtctc gcgtttccgg 180tggcaggaaa aacgcatgga ccgggcggtg cccatgcctc cggtttccgt gctcaagccc 240ctccacggcg atgaaccgct gctggaggaa gcgcttgaaa gcttctgcac gcaggattac 300ccgcagatgc agatcgtctt tggcgtacag gccgaagacg atgcggcgat cccgatcgta 360caacggttga tggaacgcca cccggatgtg cagatggaac tggtgattga ccccaccttc 420cacgggctca accgcaagat cggcaacctg atcaacatca tgacgcgcgt gaagcatgat 480gtcctggtca tttccgattc ggatatccac gttgcccccg attacctgcg gcatgtggtg 540ggcgccatgg tgcccgacaa tgtcggcctg gtcacgacgc tgtacgcggg gctgcccgcg 600tcatccacgc tgccgcgcct gctggccgca tgccagatca accataactt cctgcccggc 660gtgatgctgt cactctacct cgggcggcag gactgccttg gggcgacaat ggcgctgcgg 720cgttccatgc tggacgaaat cggcgggctg gaagccctcg tgccgcatgt ggccgatgat 780gcgatactgg gccgttacgt gcgtgaccgt ggcaaggata tcgccattgc cgcgtgcatg 840acctggacca ccgtgggcga gacctcgatg cgtgaggtgc tggcgcatga actgcgctgg 900ggccggaccg tcaagacgct ggagcctgcg ggttatgccg catccgccat ccagctgccc 960ctgttctggg ccagcgtcgc cgtgcttgcc gcgccgcatg cgacctggac atggtccttc 1020tttcttggtg catggggatg gcgggccgtg tgttccttca tcctggaccg tacgctggcg 1080caacgtagtc tggtgctgcc gtcactgctt ctgccactgc gcgactggat ctcggccgcc 1140gtcatggtgg gcagtgtcac tggcacgcgg gttgcatggc gtgggcagac aatgcatgtc 1200acgccccatt cggtcatgac accacgatcg caaccggctt cccccggtga ctgacccgcc 1260gtcagcaggc tgaactgctt gagaattcca accctgtcgt taataagaac ggg 1313<210>2
<211>393<212>PRT<213>Gluconacetobacter entanii<400>2Met Ser Val Phe Asn Ala Leu Val Ser Pro Ala Gly Leu Ala Ala Thr5 10 15Val Ala Val Ala Gly Cys Met Gln Ala Ala Leu Gly Thr Phe Leu Val20 25 30Ser Arg Phe Arg Trp Gln Glu Lys Arg Met Asp Arg Ala Val Pro Met35 40 45Pro Pro Val Ser Val Leu Lys Pro Leu His Gly Asp Glu Pro Leu Leu50 55 60Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Cys Thr Gln Asp Tyr Pro Gln Met Gln65 70 75 80Ile Val Phe Gly Val Gln Ala Glu Asp Asp Ala Ala Ile Pro Ile Val85 90 95Gln Arg Leu Met Glu Arg His Pro Asp Val Gln Met Glu Leu Val Ile100 105 110Asp Pro Thr Phe His Gly Leu Asn Arg Lys Ile Gly Asn Leu Ile Asn115 120 125Ile Met Thr Arg Val Lys His Asp Val Leu Val Ile Ser Asp Ser Asp130 135 140Ile His Val Ala Pro Asp Tyr Leu Arg His Val Val Gly Ala Met Val145 150 155 160Pro Asp Asn Val Gly Leu Val Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Leu Pro Ala165 170 175Ser Ser Thr Leu Pro Arg Leu Leu Ala Ala Cys Gln Ile Asn His Asn180 185 190Phe Leu Pro Gly Val Met Leu Ser Leu Tyr Leu Gly Arg Gln Asp Cys195 200 205Leu Gly Ala Thr Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Leu Asp Glu Ile Gly210 215 220Gly Leu Glu Ala Leu Val Pro His Val Ala Asp Asp Ala Ile Leu Gly225 230 235 240Arg Tyr Val Arg Asp Arg Gly Lys Asp Ile Ala Ile Ala Ala Cys Met245 250 255Thr Trp Thr Thr Val Gly Glu Thr Ser Met Arg Glu Val Leu Ala His260 265 270Glu Leu Arg Trp Gly Arg Thr Val Lys Thr Leu Glu Pro Ala Gly Tyr
275 280 285Ala Ala Ser Ala Ile Gln Leu Pro Leu Phe Trp Ala Ser Val Ala Val290 295 300Leu Ala Ala Pro His Ala Thr Trp Thr Trp Ser Phe Phe Leu Gly Ala305 310 315 320Trp Gly Trp Arg Ala Val Cys Ser Phe Ile Leu Asp Arg Thr Leu Ala325 330 335Gln Arg Ser Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Leu Pro Leu Arg Asp Trp340 345 350Ile Ser Ala Ala Val Met Val Gly Ser Val Thr Gly Thr Arg Val Ala355 360 365Trp Arg Gly Gln Thr Met His Val Thr Pro His Ser Val Met Thr Pro370 375 380Arg Ser Gln Pro Ala Ser Pro Gly Asp385 390 393<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3gaagagtgat attacacttc cctgacgccg<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>4cccgttctta ttaacgacag ggttgg<210>5<211>5734<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii(Acetobacter altoacetigenes MH-24)<400>5catggggcgt cacccccagc ggccagcttg gctacctgat ggacagggcg ggccttctgc 60
aagccctcgg ccactgccat ctgccgggat atgaggccaa atacgaaccg aaggaaaagc 120gcaccttctg ctaccccacc cagaacgcca gcggctgggc tgtgcagcca tgatcgccaa 180cccctccctc ttcctgagca attcggaaga gcgatttccg ccgactgaac acgtcgaaaa 240tggcagtttt ccaccgaaaa aaggaaagga ccataggaaa ggattaatat cttattttta 300tctaggggtt tgccgatccg cgattttcgc tgggaaaccg ccaaaaatgg cttgccatta 360ggtcgcacca catgcgacca taaagtcgca cagtgtgcga cctattcggc ccatatacag 420aggttcccca catgcggaat gtcacccgtc tcaagacccg caaagaccgg ctccgcgagg 480accaagccga cctgttgaag caagcccttc tgcccttcgc agaggacgat ggaccgatgc 540gggatgcggt cggacggctc tacgtccaga tcaagaacct caccacccca gaccccggaa 600ccacggagcc gttcgtcatg atccgtcccg cccagaatcg cgccgtcacc ctctggctgc 660tgaagaacag taagcggccc atgaaggccg tggacgtatg gacgctgctg ttcgaccacc 720tgtttcccca taccggccag atcatgctga cccgtgagga aatcgcggaa aaagtcggta 780tccgggtcaa cgaagttaca gccgtcatga acgagctggt gagcttcggc gcgattttct 840ccgagcgcga gaaggtggcc ggaatgcgcg ggccgggcct cgcccgctac tacatgaacc 900ggcatgtggc cgaggtcggc agccgcgcca cgcaggaaga acttgcccta atcccacgcc 960ccggcgccaa gctggcagtc gtgcagggtg gcaaggctta acccatgaag gtttcggaac 1020tggacgtgtt cgacagcgcc aaggcggcac aagacccgtt ggtgcgggaa gaactgctgc 1080aagcagcgca ggcggacggc cacggccccg ccctcgctca tgcccgttcc gtcatagcca 1140aggcgcgggc cgggcaggac gccaaggctt aacggccccg ccctctcccg cctcgatccc 1200ggcgggcctg tagcatctcc tgatgctcct tggcgttttt ggcccgctgc tcggcccgct 1260ctttctcggc cgctgcggct cttaggcgct cttcggccag ccgcatccgc tcgtccatct 1320gacgtttccg atctgcctcg gcatccttgg cggctcctgc cttcagccct ttgctgaaag 1380ccatccactt attggcggtt ttctcggctt tctgctgtat cggcggggtc agccggtcaa 1440atgcctgggc caccctctcg aagccctcac gcatggcgtt gacggcctgc gccagtttag 1500ccagggcgaa atctatcacc tcggcccgct gggcgttctc ggcccggata cgccggttgt 1560ggttgccggt cggggtctgg tggcccttcc gttccagagc caccacattc ggccccatgt 1620gccgctctgg aacgcggtct agcccctgct ccgcattgct ccggtgatct atccgggcct 1680cttgcccagc ccgctctagc gcggcattgg caaggcccgc ccatagctgc cggatttcct 1740tcacctcgtc ggcggccttc cccagtccca tgccctgccg cttcttgtcg gacagttcga 1800tggttgattt gtctccaaag gacagcttgc catcggcccc ccgctccacc gtgcgggtgg 1860tggtcatgat gtgcgcgtga tgattccggt cgtcgccctc gtcacccgga agatgcacgg 1920ccacgtccac ggccaccccg taccgctgga ccaactcacg cgcgaaactg tccgccagtt 1980cggcccgctg ctcgctggtg agttcatgag ggagggccac aacccattcc ctcccggtgc 2040gggcgtcctt gcgtttctct gatcgctccg cgtcattcca caattccgaa cggtcagcgg 2100tgccaccccc cggaatgaaa attgccttat gggcaacgct attctgcctg gggctgtatt 2160tgtgttcgtg cccgtcaacc tcgttggtca aatcctcgcc agcacgatac gcagccgcag 2220ccacaacgga acgccctgcg ctccggctga tcggtttcgt ttctgcgcga tagattgcca 2280cggatcgagc gcctaccttt tggagttaaa cggggggttc aggggggcga agccaccatg 2340acgcaggact tgcacttgtg caagtcgtaa ctgcgccctt aatacctgac ggcatcaagg 2400
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權(quán)利要求
1.下述(A)或(B)中所示的蛋白質(zhì)GCS(A)具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)由包含在序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入、添加或倒位一個或幾個氨基酸所得的氨基酸序列組成的，且具有提高溫度耐受性的功能的蛋白質(zhì)。
2.編碼在下面(A)或(B)中所示的蛋白質(zhì)的新基因的DNA(A)具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)由包含在序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入、添加或倒位一個或幾個氨基酸所得的氨基酸序列組成的，且具有提高溫度耐受性的功能的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的基因的DNA，它是在下面(a)或(b)中所示的DNA(a)包含由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的第73到1251位核苷酸組成的核苷酸序列的DNA，(b)與包含由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的第73到1251位核苷酸或其部分組成的核苷酸序列的探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼一種具有提高溫度耐受性功能的蛋白質(zhì)的DNA。
4.一種微生物，它的溫度耐受性通過擴增根據(jù)權(quán)利要求
2或3的DNA的細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)而得以提高。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的微生物，其特征在于該微生物是一種屬于醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸細(xì)菌。
6.一種生產(chǎn)醋的方法，其特征在于在包含乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求
4或5的微生物中具有乙醇氧化能力的微生物，由此即使在高培養(yǎng)溫度下也能生產(chǎn)并在培養(yǎng)基中積累醋酸。
7.一種重組質(zhì)粒pUCGCS(FERM BP-8217)，其至少包括根據(jù)權(quán)利要求
2或3的DNA。
專利摘要
本發(fā)明意在提供一種來源于醋酸細(xì)菌的新基因，它涉及溫度耐受性；一種利用以上基因提高微生物，特別是一種醋酸細(xì)菌的溫度耐受性的方法；以及一種利用溫度耐受性得到提高的醋酸細(xì)菌有效生產(chǎn)具有較高醋酸濃度的醋的方法。在本發(fā)明中，從醋酸細(xì)菌的染色體DNA文庫中，通過使用一種獲得基因的方法從屬于葡糖酸醋酸桿菌屬的實用的醋酸細(xì)菌中克隆一種涉及溫度耐受性的新基因，所述基因具有即使在通常不能生長的條件下也使生長成為可能的功能。另外，在將該基因?qū)氪姿峒?xì)菌內(nèi)的轉(zhuǎn)化子中，溫度耐受性顯著提高，并且當(dāng)轉(zhuǎn)化子在乙醇存在的情況下進行通氣攪拌培養(yǎng)時，最終的醋酸濃度可以顯著提高。
文檔編號C12N1/21GKCN1723280SQ200380105381
公開日2006年1月18日 申請日期2003年12月4日
發(fā)明者后藤英嗣 申請人:株式會社味滋集團公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan