本發(fā)明涉及基因育種，尤其涉及一種絨山羊gng4基因插入或缺失多態(tài)性的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)快速發(fā)展的重要支柱之一，而陜北白絨山羊是我國(guó)著名的絨用品種，具有耐粗飼、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)陜北白絨山羊的需求日益增長(zhǎng)，因此選育生長(zhǎng)性狀優(yōu)秀的個(gè)體一直是山羊產(chǎn)業(yè)的重要問題，而利用傳統(tǒng)選育方法對(duì)生長(zhǎng)性狀優(yōu)良羊只選育耗時(shí)長(zhǎng)、過程繁瑣。

2、動(dòng)物育種技術(shù)主要包括以表型和表型值為基礎(chǔ)的常規(guī)育種技術(shù)及dna多態(tài)為基礎(chǔ)的分子育種技術(shù)。分子標(biāo)記輔助選擇是指通過分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的基因型，借助分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀基因型進(jìn)行選擇。分子標(biāo)記輔助育種縮短了育種年限，加快了育種進(jìn)程，提高了育種效率，使得育種過程更加精確和高效。

3、插入和缺失(insertion?and?deletion，indel)，是指在基因組序列中發(fā)生的小片段的插入或缺失，其長(zhǎng)度在1-50bp之間。indel涉及的變化并不單單是單個(gè)堿基上的，是dna序列上某一位點(diǎn)相比參考序列插入或缺失了一個(gè)或多個(gè)堿基。基于indel標(biāo)記準(zhǔn)確性高和變異穩(wěn)定的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物群體構(gòu)建遺傳圖譜、分子輔助育種以及醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域。目前，已有的indel研究在家畜相關(guān)報(bào)道：mao等報(bào)道稱dyrk2基因11bp?indel與六種不同的牛奶性狀顯著相關(guān)(mao?c,ju?x,cheng?h,huang?x,jiang?f,yao?y,lan?x,songe.determination?of?genetic?variation?within?the?dyrk2?gene?and?itsassociations?with?milk?traits?in?cattle.arch?anim?breed.2020sep9；63(2):315-323.doi:10.5194/aab-63-315-2020.pmid:32964102；pmcid:pmc7500071.)；kang等發(fā)現(xiàn)陜北白絨山羊akap12基因13bp插入缺失突變與窩產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)(kang?z,bai?y,lan?x,zhao?h.goat?akap12:indel?mutation?detection,association?analysis?with?littersize?and?alternative?splicing?variant?expression.front?genet.2021may?21；12:648256.doi:10.3389/fgene.2021.648256.pmid:34093646；pmcid:pmc8176285.)；chen等檢測(cè)豬sox9基因的插入缺失以及sox9基因在7日齡和5月齡豬sertoli細(xì)胞中的相應(yīng)表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，sox9的插入缺失多態(tài)性和表達(dá)與豬繁殖性狀顯著相關(guān)(chen?m,wang?j,liun,cui?w,dong?w,xing?b,pan?c.pig?sox9:expression?profiles?of?sertoli?cell(scs)and?a?functional?18bp?indel?affecting?testis?weight.theriogenology.2019oct15；138:94-101.doi:10.1016/j.theriogenology.2019.07.008.epub?2019jul?9.pmid:31319268.)。上述研究均表明indel突變對(duì)于家畜分子輔助育種具有研究?jī)r(jià)值和參考意義。

4、g蛋白亞基γ4(gng4)是g蛋白三聚體γ家族的成員之一，在大腦、卵巢和結(jié)腸等內(nèi)臟組織中表達(dá)，研究表明，gng4參與調(diào)節(jié)骨化、b細(xì)胞活化和細(xì)胞周期，與部分癌細(xì)胞活力、增殖和侵襲有關(guān)。

5、目前尚未見到絨山羊gng4基因與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種絨山羊gng4基因插入/缺失標(biāo)記的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，有助于通過篩選并結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種對(duì)山羊的早期生長(zhǎng)性狀進(jìn)行早期選育。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種絨山羊gng4基因nc_030835.1:g.37065369_37065370插入或缺失多態(tài)性位點(diǎn)在山羊生長(zhǎng)性狀輔助選擇育種中的應(yīng)用，所述插入或缺失多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、進(jìn)一步的，所述山羊生長(zhǎng)性狀包括以下中的至少一個(gè)：體長(zhǎng)、胸深、胸圍、胸寬。

5、進(jìn)一步的，所述絨山羊gng4基因nc_030835.1:g.37065369_37065370插入或缺失多態(tài)性位點(diǎn)包括3個(gè)基因型：插入/插入基因型、插入/缺失基因型、缺失/缺失基因型；

6、所述缺失/缺失基因型為絨山羊優(yōu)良生長(zhǎng)性狀基因型。

7、本發(fā)明提供一種絨山羊gng4基因插入/缺失多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括pcr擴(kuò)增絨山羊gng4基因nc_030835.1:g.37065369_37065370位的引物對(duì)和pcr反應(yīng)液；

8、所述引物對(duì)包括：

9、上游引物：5’-ccaagtgtcaacaggctcca-3’；

10、下游引物：5’-tcggaactgagtgatgagcg-3’。

11、本發(fā)明提供一種對(duì)山羊生長(zhǎng)性狀進(jìn)行輔助選擇育種的方法，包括以下步驟：

12、以待檢測(cè)絨山羊全基因組為模板，通過pcr擴(kuò)增gng4基因，并得到包含絨山羊gng4基因nc_030835.1:g.37065369_37065370的片段；

13、對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并根據(jù)電泳結(jié)果，鑒定所述突變位點(diǎn)是否為：插入/插入基因型、插入/缺失基因型、缺失/缺失基因型；

14、根據(jù)突變位點(diǎn)的基因型對(duì)山羊生長(zhǎng)性狀進(jìn)行輔助選擇育種。

15、進(jìn)一步的，通過pcr擴(kuò)增gng4基因時(shí)，采用的引物對(duì)為：

16、上游引物：5’-ccaagtgtcaacaggctcca-3’；

17、下游引物：5’-tcggaactgagtgatgagcg-3’。

18、進(jìn)一步的，所述pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

19、94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

20、所述電泳均采用質(zhì)量濃度為3％的瓊脂糖凝膠。

21、進(jìn)一步的，所述插入/插入基因型的核酸電泳表現(xiàn)為347bp的一條帶紋；所述插入/缺失基因型核酸電泳表現(xiàn)為347bp和323bp的兩條帶紋；所述缺失/缺失基因型核酸電泳表現(xiàn)為323bp的一條帶紋。

22、進(jìn)一步的，所述山羊品種為陜北白絨山羊。

23、本發(fā)明至少具備以下有益效果：

24、本發(fā)明根據(jù)絨山羊gng4基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以絨山羊基因組dna為模板，通過pcr擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳和直接測(cè)序技術(shù)，能夠精確、快速和低成本的檢測(cè)絨山羊gng4基因nc_030835.1:g.37065369_37065370位的插入/缺失多態(tài)性；

25、本發(fā)明利用pcr擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)絨山羊gng4基因插入/缺失多態(tài)性，并進(jìn)行基因型和等位基因頻率分析，首次發(fā)現(xiàn)gng4基因與陜北白絨山羊生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)，可作為陜北白絨山羊生長(zhǎng)性狀遺傳育種的有效dna標(biāo)記。