本發(fā)明屬于食品加工，具體涉及一種復(fù)合改性β-乳球蛋白及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，簡稱β-lg）主要存在于牛奶和其他哺乳動(dòng)物的乳汁中，是乳清蛋白的主要成分，約占乳清蛋白總量的50%，由兩條相同的多肽鏈以二聚體形式存在，每條多肽鏈約160~162個(gè)氨基酸殘基，整體分子量約為18~25?kda，其中兩個(gè)二硫鍵形成的典型α/β卷曲結(jié)構(gòu)對(duì)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要。同時(shí)，β-乳球蛋白富含多種必需氨基酸，能促進(jìn)人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抗菌抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、助力生長發(fā)育和改善睡眠功能。此外，β-乳球蛋白水解物還具有降低膽固醇、改善腸道菌群和促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等功效，且易于人體消化吸收。因此，合理攝入β-乳球蛋白能充分發(fā)揮其豐富的營養(yǎng)價(jià)值。然而，對(duì)于特定人群，特別是嬰兒和免疫系統(tǒng)敏感者，β-乳球蛋白可能引發(fā)過敏反應(yīng)。盡管存在潛在的限制因素，但β-乳球蛋白憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特性，在食品加工、營養(yǎng)補(bǔ)充及醫(yī)藥領(lǐng)域依然展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力和價(jià)值。

2、琥珀酸酐，亦稱丁二酸酐?(succinic?anhydride，sa)，作為具有獨(dú)特環(huán)狀酸酐的有機(jī)化合物?(c4h4o3)，憑借其獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，在醫(yī)藥、化工及食品工業(yè)中占據(jù)重要地位。在醫(yī)藥中它是多種藥物的關(guān)鍵原料；在化工領(lǐng)域中作為化學(xué)中間體和樹脂硬化劑發(fā)揮重要作用；在食品工業(yè)中則作為酸味劑、增稠劑和風(fēng)味劑使用。此外，琥珀酸酐常用于改性蛋白質(zhì)，以此提升蛋白質(zhì)的功能活性，包括溶解性、熱穩(wěn)定性和乳化性等。研究表明，琥珀酸酐主要與蛋白氨基（特別是賴氨酸的ε-氨基）發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成酰胺鍵，顯著改變蛋白質(zhì)表面的空間結(jié)構(gòu)，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)伸展，破壞氫鍵和疏水作用力，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的調(diào)整，進(jìn)而影響其功能活性。但由于β-乳球蛋白是球形蛋白，內(nèi)部賴氨酸難以直接觸及，需將其結(jié)構(gòu)進(jìn)行部分展開，使琥珀酸酐能夠進(jìn)入蛋白內(nèi)部或內(nèi)部活性位點(diǎn)暴露，從而促進(jìn)反應(yīng)修飾效果最大化，更好的優(yōu)化其功能性質(zhì)。因此，復(fù)合處理技術(shù)在蛋白質(zhì)改性中顯得尤為重要，為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)性能的飛躍性提升奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3、蛋白改性是指通過物理、化學(xué)或生物方法調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而賦予其更優(yōu)的功能性質(zhì)。其中，化學(xué)改性如磷酸化、糖基化、多酚化，通過化學(xué)鍵的引入來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表面電荷和親水-疏水性；生物改性主要利用酶的高效催化實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的特異性水解或交聯(lián)，優(yōu)化了其溶解度和乳化性；物理改性能夠在不引入雜質(zhì)的同時(shí)通過物理手段直接作用于蛋白質(zhì)，改變其表面電荷和結(jié)構(gòu)。然而，單一的改性處理往往難以深入的優(yōu)化蛋白性能。在此背景下，復(fù)合改性技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它巧妙融合了物理、化學(xué)或生物改性方式，將兩種或多種方式相結(jié)合，通過協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的多維度、深層次調(diào)控。如高壓能夠通過高壓力產(chǎn)生強(qiáng)烈的壓強(qiáng)，裂解蛋白分子間的緊密結(jié)合，促進(jìn)其結(jié)構(gòu)部分展開，該過程高效且效果明顯，為后續(xù)反應(yīng)提供了有利條件，使其能夠顯著提升蛋白質(zhì)的抗氧化和乳化性能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是為了克服β-乳球蛋白因結(jié)構(gòu)緊密導(dǎo)致功能基團(tuán)被掩埋，具有低的溶解度、乳化性和抗氧化性等缺點(diǎn)，這限制了其在食品及生物領(lǐng)域的應(yīng)用。因此提供一種復(fù)合改性β-乳球蛋白及其制備方法與應(yīng)用，并將其應(yīng)用于乳制品、運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品、功能性食品、烘焙食品以及其他食品。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種復(fù)合改性β-乳球蛋白的制備方法，包括以下步驟：

3、（1）將β-乳球蛋白粉末溶于去離子水形成β-乳球蛋白溶液，并隨后經(jīng)過微射流處理，得到微射流改性的β-乳球蛋白溶液；

4、（2）將微射流改性的β-乳球蛋白溶液進(jìn)行琥珀?；幚?，得到微射流輔助的酰化β-乳球蛋白，隨后將酰化β-乳球蛋白溶液透析進(jìn)行純化處理，最后進(jìn)行冷凍干燥得到復(fù)合改性酰化β-乳球蛋白。

5、進(jìn)一步地，所述β-乳球蛋白粉末的制備方法包括：

6、從乳清蛋白中提取出β-乳球蛋白，室溫下透析處理，隨后進(jìn)行冷凍干燥得到高純化的β-乳球蛋白粉末。

7、進(jìn)一步地，從乳清蛋白中提取出β-乳球蛋白，室溫下透析處理，隨后進(jìn)行冷凍干燥得到高純化的β-乳球蛋白粉末，包括：

8、將濃度為4.0~6.0wt%的乳清蛋白溶液用1m?檸檬酸調(diào)ph至3.5~4，30~40℃水浴加熱60~80min后離心取上清液；加入7.0~7.5wt%的氯化鈉進(jìn)行鹽析處理，時(shí)間為50~70min，后進(jìn)行離心處理收集上清液，重復(fù)一次；溶液透析48h后冷凍干燥備用。

9、其中，乳清蛋白濃度在4.0~6.0wt%具有較好的提取效率，同時(shí)成本受控和純度受保障，濃度低于4.0wt%會(huì)降低提取效率，成本增加；濃度高于6wt%會(huì)增加處理難度造成純度下降，設(shè)備負(fù)荷增加導(dǎo)致成本上升。β-乳球蛋白的等電點(diǎn)通常在5.1~5.3，將ph調(diào)至3.5~4意味著β-乳球蛋白在一個(gè)低于等電點(diǎn)的酸性環(huán)境中，此環(huán)境下β-乳球蛋白具有低的溶解度，促進(jìn)其分離和純化。同時(shí)，在低ph環(huán)境下，一些與β-乳球蛋白性質(zhì)相似的雜質(zhì)也會(huì)發(fā)生沉淀，從而提高提取純度。檸檬酸作為天然添加劑，具有安全性和環(huán)保型，符合可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)其弱酸性能夠保持營養(yǎng)成分不被破壞，優(yōu)化后續(xù)鹽析效果。

10、30~40℃的溫度有助于促進(jìn)β-乳球蛋白與其他蛋白組分發(fā)生分離，減少雜質(zhì)干擾，最重要是能保持蛋白功能活性。高于40℃可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，降低其生物活性和功能，同時(shí)雜質(zhì)增加，能耗增加。低于30℃可能會(huì)降低提取效率，同時(shí)增加微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。加熱60~80min能夠很好的促進(jìn)蛋白分子運(yùn)動(dòng)，同時(shí)保持蛋白活性和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。低于60min可能導(dǎo)致提取不完全，雜質(zhì)殘留；高于80min可能存在局部過熱現(xiàn)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，能耗增加，設(shè)備負(fù)擔(dān)加重。

11、鹽析濃度在7~7.5wt%時(shí)，既能保持β-乳球蛋白的低溶解度，又能保持其生物活性。濃度高于7.5wt%會(huì)導(dǎo)致蛋白過度聚集形成沉淀，影響其生物活性和功能。濃度低于7wt%會(huì)導(dǎo)致蛋白溶解度降低不明顯，難以達(dá)到理想的分離效果。在50~70min內(nèi)分兩次進(jìn)行的鹽析效果最佳，β-乳球蛋白充分析出。處理時(shí)間單次超過140min時(shí)，蛋白質(zhì)長時(shí)間暴露在高濃度鹽環(huán)境下使其變性風(fēng)險(xiǎn)增加，同時(shí)可能重新溶解或發(fā)生其他不利反應(yīng)導(dǎo)致分離純化效率降低，造成資源浪費(fèi)。處理時(shí)間低于60min時(shí)鹽離子沒有充分破壞蛋白質(zhì)的水化層，導(dǎo)致鹽析不完全，分離效果差而添加額外的步驟，增加成本，因此分兩次既可以減少對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，又可以充分鹽析。

12、進(jìn)一步地，所述乳清蛋白溶液用1m?檸檬酸調(diào)ph至3.5~4。

13、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中β-乳球蛋白溶液的濃度為0.5~1.5wt%。

14、其中，β-乳球蛋白濃度在0.5~1.5wt%最為適宜。濃度高于1.5wt%會(huì)導(dǎo)致處理難度增加，蛋白溶液變粘稠，通過高壓微射流時(shí)會(huì)導(dǎo)致設(shè)備磨損或者堵塞，同時(shí)過高濃度會(huì)造成部分β-乳球蛋白發(fā)生過度聚集，影響蛋白的乳化活性。濃度低于0.5wt%會(huì)導(dǎo)致改性處理的效果不顯著，且操作復(fù)雜化，對(duì)蛋白的乳化性質(zhì)和抗氧化特性影響不顯著，因低濃度需要更精確的控制條件和更復(fù)雜的操作流程，經(jīng)濟(jì)效益低。

15、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中微射流處理的壓強(qiáng)為50~100mpa。

16、其中，高壓微射流能夠?qū)ⅵ?乳球蛋白的顆粒分散，使得粒徑降低，促進(jìn)其溶解度和分散性增加，同時(shí)結(jié)構(gòu)明顯，暴露更多的活性位點(diǎn)，促進(jìn)后續(xù)?；磻?yīng)，提高蛋白乳化和抗氧化特性。當(dāng)壓強(qiáng)大于100mpa時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)被過度破壞導(dǎo)致出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，同時(shí)一些活性位點(diǎn)被破壞影響?；磻?yīng)進(jìn)行，降低抗氧化活性。當(dāng)壓強(qiáng)小于50mpa時(shí)，較低壓力不足以打破分子間作用力，無法將其結(jié)構(gòu)展開，溶解度降低，乳化活性受影響，難達(dá)到理想效果。

17、進(jìn)一步地，所述步驟（2）包括：

18、將步驟（1）中微射流改性的β-乳球蛋白溶液添加濃度為4%~20%（w/w）琥珀酸酐，進(jìn)行水浴恒溫磁力攪拌，酰化反應(yīng)ph始終保持8~8.5，溫度35~50℃，攪拌120~150min，形成微射流輔助的?；?乳球蛋白溶液；再進(jìn)行透析處理48h除去多余的琥珀酸酐和雜質(zhì)得到純化的微射流輔助的?；?乳球蛋白溶液，將純化的微射流輔助的?；?乳球蛋白溶液進(jìn)行真空冷凍干燥處理得到粉末狀樣品，即復(fù)合改性β-乳球蛋白。

19、其中，琥珀酸酐濃度在4%~20%包含了?；鹊椭懈呷齻€(gè)層次，當(dāng)質(zhì)量比低于4%時(shí)，蛋白酰化度不明顯，反應(yīng)不完全，不能顯著提升蛋白的抗氧化能力和乳化性能。當(dāng)質(zhì)量比高于20%時(shí)，蛋白?；茸兓幻黠@，開始出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，造成資源浪費(fèi)，成本增加。?；^程中，溫度控制在37~50℃時(shí)利于反應(yīng)的控制和產(chǎn)物的生成，同時(shí)不會(huì)對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響。?；瘻囟雀哂?0℃時(shí)蛋白易發(fā)生變性聚集，溶解度降低，同時(shí)副產(chǎn)物可能增加導(dǎo)致樣品純度降低。?；瘻囟鹊陀?7℃時(shí)反應(yīng)速率緩慢，效率低，時(shí)間延長，能耗大，成本增加。?；磻?yīng)ph在8~8.5之間時(shí)會(huì)促進(jìn)蛋白氨基去質(zhì)子化，增加其反應(yīng)活性，同時(shí)該ph范圍不會(huì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)造成顯著破壞。ph高于8.5會(huì)導(dǎo)致氨基過度去質(zhì)子化，增加非特異性反應(yīng)的進(jìn)行，降低?；?乳球蛋白純度從而降低其乳化活性。ph低于8會(huì)使反應(yīng)活性降低，氨基質(zhì)子化程度增加，降低反應(yīng)速率從而影響β-乳球蛋白的乳化活性和抗氧化性能。

20、進(jìn)一步地，通過濃度為1~2m的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至8~8.5。

21、其中，濃度適宜能夠更高效的快速調(diào)節(jié)ph值，減少不必要的副反應(yīng)，從而提高產(chǎn)物純度和質(zhì)量。濃度大于2m會(huì)增加副反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，影響反應(yīng)速率，同時(shí)高堿性環(huán)境會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)改變，影響其溶解度和乳化活性，此外還會(huì)存在一定的安全隱患。濃度低于1m會(huì)導(dǎo)致調(diào)整時(shí)間過長，降低反應(yīng)效率，精確度降低，無法及時(shí)達(dá)到反應(yīng)最適ph，使反應(yīng)效率降低，進(jìn)一步影響其抗氧化能力。

22、進(jìn)一步地，根據(jù)上述的制備方法制備的復(fù)合改性β-乳球蛋白。

23、進(jìn)一步地，根據(jù)上述的制備方法制備的復(fù)合改性β-乳球蛋白或上述的復(fù)合改性β-乳球蛋白在蛋白質(zhì)加工功能中的應(yīng)用。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

25、（1）本發(fā)明通過高壓微射流輔助琥珀?；磻?yīng)對(duì)β-乳球蛋白進(jìn)行復(fù)合改性，因琥珀?；趬A性環(huán)境下帶負(fù)電，因此有效增加了β-乳球蛋白的絕對(duì)電位，促進(jìn)蛋白與蛋白之間的排斥，增強(qiáng)其溶解度，同時(shí)琥珀酸酐具有良好的親油性質(zhì)，與蛋白反應(yīng)后形成?；?乳球蛋白復(fù)合物，其乳化性得到顯著提升。

26、（2）本發(fā)明通過高壓微射流輔助顯著提升β-乳球蛋白與琥珀酸酐的結(jié)合，通過化學(xué)改性方法顯著增強(qiáng)β-乳球蛋白的抗氧化性能，且復(fù)合物的制備工藝簡單高效，成本低，因此在食品加工領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。

27、（3）?；沟忙?乳球蛋白的電荷發(fā)生改變，從而使得分子間的相互作用力減弱，更有利于形成穩(wěn)定的界面膜。