本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)，涉及一種產(chǎn)酸性蛋白酶的疏棉狀嗜熱絲孢菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、微生物產(chǎn)生的蛋白酶根據(jù)耐酸堿性不同，被分為酸性、中性以及堿性蛋白酶。而酸性蛋白酶是指在酸性條件下水解蛋白質(zhì)生成較小的肽段或氨基酸的一類(lèi)酶，這類(lèi)酶在酸性環(huán)境下能夠保持較高的活性和穩(wěn)定性，從而有效水解蛋白質(zhì)。酸性蛋白酶作為一類(lèi)重要的酶類(lèi)，在食品、飼料、醫(yī)療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

2、二氧化碳，產(chǎn)生多種有機(jī)酸，如乳酸、乙酸等。同時(shí)，微生物在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使得釀造環(huán)境呈現(xiàn)酸性。這種酸性環(huán)境有助于抑制某些有害微生物的生長(zhǎng)，保證發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行。其中部分微生物會(huì)分泌各種酶類(lèi)，包括酸性蛋白酶等。這些酶類(lèi)在酸性環(huán)境下能夠發(fā)揮更好的作用，通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)水解、改善發(fā)酵條件、提高酒體風(fēng)味及出酒率和原料利用率等方面在白酒釀造和制曲中發(fā)揮重要作用。因此，在白酒釀造及制曲過(guò)程中添加適量的酸性蛋白酶是非常有必要的。

3、目前的研究中，具有產(chǎn)酸性蛋白酶能力的微生物主要包括多種霉菌、酵母菌、芽孢桿菌及嗜熱真菌類(lèi)等。霉菌類(lèi)，主要包括曲霉屬中黑曲霉、宇佐美曲霉、米曲霉，青霉屬中的產(chǎn)黃青霉、灰綠青霉，根霉屬中的米根霉等，如cn109161489a公開(kāi)了一種高產(chǎn)酸性蛋白酶的黑曲霉菌株；cn102676395a公開(kāi)了一株宇佐美曲霉突變菌株及其在制備酸性蛋白酶中的應(yīng)用。酵母類(lèi)，如cn111286463a公開(kāi)了一種產(chǎn)酸性蛋白酶的巴斯德畢赤酵母菌株。芽孢桿菌類(lèi)，如cn118086106a公開(kāi)了一種波茨坦短芽孢桿菌及其在產(chǎn)酸性蛋白酶中的應(yīng)用；如cn117603889b公開(kāi)了飼用產(chǎn)酸性蛋白酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用；如cn114874942b公開(kāi)了一株產(chǎn)蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌及其在大曲中的應(yīng)用。

4、然而，鮮有報(bào)道有關(guān)疏棉狀嗜熱絲孢菌產(chǎn)酸性蛋白酶的研究。疏棉狀嗜熱絲孢菌(thermomyces?lanuginosus)是一種廣泛分布的嗜熱真菌，最適生長(zhǎng)溫度約為50℃，最高生長(zhǎng)溫度可達(dá)60℃，顯示出極強(qiáng)的耐熱性。該菌能夠分泌多種具有優(yōu)良熱穩(wěn)定性和廣泛ph適應(yīng)范圍的酶類(lèi)，如木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。目前已有許多研究者分離出了疏棉狀嗜熱絲孢菌，但均未研究過(guò)疏棉狀嗜熱絲孢菌產(chǎn)酸性蛋白酶情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)酸性蛋白酶的疏棉狀嗜熱絲孢菌及其應(yīng)用。該疏棉狀嗜熱絲孢菌提高了發(fā)酵過(guò)程酶系活性和多樣性，彌補(bǔ)目前大曲中的酶系不夠全面或活性不足等問(wèn)題，從而改善酒質(zhì)和出酒率，應(yīng)用于白酒制曲及相關(guān)食品發(fā)酵過(guò)程，具有廣泛的應(yīng)用前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)酸性蛋白酶的疏棉狀嗜熱絲孢菌，所述產(chǎn)酸性蛋白酶的疏棉狀嗜熱絲孢菌為疏棉狀嗜熱絲孢菌(thermomyces?lanuginosus)tl-s5菌株，保藏編號(hào)為cctcc?no：m?20241912，保藏日期為2024年09月04日。

4、本發(fā)明從今世緣酒業(yè)股份有限公司的大曲樣品中分離篩選并保藏了一株新的能夠高產(chǎn)酸性蛋白酶的疏棉狀嗜熱絲孢菌，該菌株經(jīng)測(cè)序分析，其16s?rdna序列如seq?idno:1所示，將測(cè)序得到的序列在genebank中進(jìn)行核酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示菌株為疏棉狀嗜熱絲孢菌。該菌株具有優(yōu)異的產(chǎn)酸性蛋白酶的能力，有著良好的產(chǎn)風(fēng)味能力，能夠產(chǎn)生多種酯、醇、酮類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)，在白酒和制曲等相關(guān)發(fā)酵過(guò)程中具有很大的應(yīng)用前景。

5、第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物由疏棉狀嗜熱絲孢菌(thermomyces?lanuginosus)tl-s5菌株接種于無(wú)菌培養(yǎng)基中在45-60℃(例如45℃、50℃、55℃、60℃等)下培養(yǎng)得到。

6、第三方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物制劑，所述微生物制劑中的菌株包括第一方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌(thermomyces?lanuginosus)tl-s5菌株。

7、優(yōu)選地，所述微生物制劑的劑型包括溶液劑或粉劑。

8、優(yōu)選地，所述微生物制劑中還包括保護(hù)劑和/或載體材料。

9、優(yōu)選地，所述保護(hù)劑選自脫脂乳、明膠、阿拉伯膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一種或至少兩種的組合。

10、優(yōu)選地，所述載體材料選自麥芽糊精、淀粉、微晶纖維素、碳酸鈣或磷酸氫鈣中的任意一種或至少兩種的組合。

11、第四方面，本發(fā)明提供第一方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌、第二方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌的培養(yǎng)物或第三方面所述的微生物制劑在生產(chǎn)酸性蛋白酶中的應(yīng)用。

12、第五方面，本發(fā)明提供第一方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌、第二方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌的培養(yǎng)物或第三方面所述的微生物制劑在白酒釀造或制曲中的應(yīng)用。

13、第六方面，本發(fā)明提供第一方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌、第二方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌的培養(yǎng)物或第三方面所述的微生物制劑在食品發(fā)酵中的應(yīng)用。

14、第七方面，本發(fā)明提供第一方面所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：

15、(1)取從今世緣酒業(yè)股份有限公司的大曲樣品粉碎，加入無(wú)菌水中孵育，得菌懸液；

16、(2)將菌懸液梯度稀釋后涂布于無(wú)菌培養(yǎng)基平板上；

17、(3)將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中，待長(zhǎng)出菌落后，分區(qū)域挑取單菌落，并在新的無(wú)菌培養(yǎng)基平板上進(jìn)一步分離純化；

18、(4)利用干酪素培養(yǎng)基對(duì)菌種培養(yǎng)進(jìn)行初篩，選擇平板上菌落周?chē)型该魅Φ漠a(chǎn)酸性蛋白酶能力較強(qiáng)的菌種；

19、(5)然后采用福林酚法測(cè)定菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的能力，對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)篩，得到產(chǎn)酸性蛋白酶能力更強(qiáng)的菌株。

20、優(yōu)選地，步驟(1)所述孵育在25-35℃(例如25℃、27℃、28℃、30℃、35℃等)恒溫?fù)u床中以100-300r/min(例如100r/min、150r/min、200r/min、250r/min、300r/min等)孵育10-50min(例如10min、20min、30min、40min、50min等)。

21、優(yōu)選地，步驟(2)和步驟(3)所述培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，其配方為：馬鈴薯浸出粉10-14g/l，葡萄糖18-22g/l，瓊脂粉12-16g/l，其余水，25℃調(diào)ph值為5.4-5.8。

22、優(yōu)選地，步驟(3)所述恒溫培養(yǎng)箱的溫度為30-50℃(例如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等)。

23、優(yōu)選地，步驟(4)所述干酪素培養(yǎng)基的配方為：干酪素8-12g/l，牛肉膏1-5g/l，氯化鈉3-7g/l，磷酸氫二鈉1-3g/l，瓊脂15-25g/l，其余水，ph值為3.6-3.8。

24、優(yōu)選地，步驟(4)所述培養(yǎng)在45-55℃(例如45℃、48℃、50℃、52℃、55℃等)下進(jìn)行24-72h(例如24h、30h、36h、42h、54h、72h等)。

25、優(yōu)選地，步驟(4)中判斷產(chǎn)酸性蛋白酶能力的方法為：水解圈直徑(d)與菌落直徑(d)的比值(d/d)越大，產(chǎn)酸性蛋白酶能力越強(qiáng)。

26、優(yōu)選地，步驟(5)所述復(fù)篩的方法具體包括：將菌株接種于麩皮培養(yǎng)基中，45-55℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)制備種子菌；將種子菌接種至小麥/大麥/豌豆混合培養(yǎng)基中，45-55℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-72天，采用福林酚法進(jìn)行酸性蛋白酶含量的測(cè)定。酸性蛋白酶含量越高，產(chǎn)酸性蛋白酶能力越強(qiáng)。

27、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

28、本發(fā)明從今世緣酒業(yè)股份有限公司的大曲樣品中分離篩選并保藏了一株新的能夠高產(chǎn)酸性蛋白酶的疏棉狀嗜熱絲孢菌，該菌株經(jīng)測(cè)序分析，其16s?rdna序列如seq?idno:1所示，將測(cè)序得到的序列在genebank中進(jìn)行核酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示菌株為疏棉狀嗜熱絲孢菌。該菌株具有優(yōu)異的產(chǎn)酸性蛋白酶的能力，有著良好的產(chǎn)風(fēng)味能力，能夠產(chǎn)生多種酯、醇、酮類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)，該疏棉狀嗜熱絲孢菌彌補(bǔ)了目前大曲中的酶系不夠全面或活性不足等問(wèn)題，從而改善酒質(zhì)和出酒率，應(yīng)用于白酒制曲及相關(guān)食品發(fā)酵過(guò)程，具有廣泛的應(yīng)用前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

29、本發(fā)明所涉及的疏棉狀嗜熱絲孢菌，其分類(lèi)命名為疏棉狀嗜熱絲孢菌tl-s5thermomyces?lanuginosus?tl-s5，保藏時(shí)間為2024年09月04日，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址為：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，保藏號(hào)為cctcc?no：m?20241912。