本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種維生素a棕櫚酸酯3種順式異構(gòu)體雜質(zhì)對(duì)照品的制備方法。

背景技術(shù)：

1、維生素a棕櫚酸酯碳鏈長(zhǎng)，熔點(diǎn)低，油溶性好，具有維持視覺(jué)、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、維持上皮結(jié)構(gòu)的完整和健全、加強(qiáng)免疫能力等生理功能，因此，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品中。

2、維生素a棕櫚酸酯是注射用多種維生素（12）、注射用12種復(fù)合維生素、多種維生素注射液（13）（10/3）、注射用多種維生素（13）、小兒多種維生素注射液（13）、小兒注射用多種維生素（13）、注射用脂溶性維生素（i）、注射用脂溶性維生素（ii）等制劑的原料藥。維生素a棕櫚酸酯不同順?lè)词疆悩?gòu)體生物效價(jià)差異較大，其中全反式異構(gòu)體是最穩(wěn)定和有效的活性成分，維生素a棕櫚酸酯順式異構(gòu)體生物活性均低于全反式，其中13-順式異構(gòu)體相對(duì)活性76%，11-順式異構(gòu)體相對(duì)活性31%，9-順式異構(gòu)體相對(duì)活性19%，9,13-雙順式異構(gòu)體相對(duì)活性?xún)H16%（俞安.?維生素a?的穩(wěn)定性研究[d].?杭州:?浙江大學(xué),?2012.）。此外，維生素a棕櫚酸酯順式異構(gòu)體易受光、熱、溶劑等因素影響，穩(wěn)定性差，因而，在維生素a棕櫚酸酯原料藥中各順式異構(gòu)體含量不穩(wěn)定、比例差異顯著，對(duì)維生素a棕櫚酸酯的研究影響很大。研究分離和制備維生素a?棕櫚酸酯順式異構(gòu)體的方法對(duì)于維生素a棕櫚酸酯原料藥的質(zhì)量控制有著重要意義。

3、維生素a棕櫚酸酯常見(jiàn)順式異構(gòu)體有13-順式異構(gòu)體、11-順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體、9,13-雙順式異構(gòu)體。其中，順式異構(gòu)體1：13-順式維生素a棕櫚酸酯，分子式為c36h60o2，分子量為524.87，其結(jié)構(gòu)式為：

4、

5、順式異構(gòu)體2：9,13-雙順式維生素a棕櫚酸酯，分子式為c36h60o2，分子量為524.87，其結(jié)構(gòu)式為：

6、

7、順式異構(gòu)體3：9-順式維生素a棕櫚酸酯，分子式為c36h60o2，分子量為524.87，其結(jié)構(gòu)式為：

8、

9、中國(guó)藥典四部通則，0721維生素a測(cè)定法第二法描述，系統(tǒng)適用性溶液的制備為取維生素a對(duì)照品適量（約相當(dāng)于維生素a醋酸酯300mg），置燒杯中，加入碘試液0.2ml，混勻，放置約10分鐘，定量轉(zhuǎn)移至200ml量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻。但使用該系統(tǒng)適用性溶液所制備得到的3種順式異構(gòu)體含量不穩(wěn)定，只能用于順式異構(gòu)體的定性試驗(yàn)，不能用于順式異構(gòu)體雜質(zhì)含量的定量研究。

10、蔣小英等（蔣小英,?任勝科.?np-hplc法快速分離維生素a乙酸酯和維生素a棕櫚酸酯5種順?lè)词疆悩?gòu)體[j].?上海化工,?2022,?47(06):?53-57.）以正相高效液相色譜（np-hplc）法在視黃醇的基礎(chǔ)上建立了維生素a乙酸酯和維生素a棕櫚酸酯的順?lè)词疆悩?gòu)體分離及鑒定方法，雖然該方法僅能夠分離13-順、11-順、9-順、9,13-順及全反式異構(gòu)體，并確定了各順式異構(gòu)體的出峰順序，但是該方法不適用于制備液相，且文獻(xiàn)內(nèi)容不涉及維生素a棕櫚酸酯的13-順式異構(gòu)體、9,13-雙順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體的制備。

11、唐蕾等在人血漿中全反式維甲酸、13-順式維甲酸和9-順式維甲酸濃度的監(jiān)測(cè)（唐蕾,?胡俊勇,?崔穎鵬,?等.?人血漿中全反式維甲酸、13-順式維甲酸和9-順式維甲酸濃度的監(jiān)測(cè)[j].?中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,?2007,?2(31):?9-11.）里采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人血漿中全反式維甲酸、13-順式維甲酸和9-順式維甲酸濃度。方法色譜柱為kromasil?c18柱（5μm，4.6?mm*250?mm）；柱溫為室溫。流動(dòng)相a：甲醇；流動(dòng)相b：0.01?mol/l醋酸鈉緩沖液（ph=5.7），梯度洗脫，流速l?ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)340?nm。結(jié)果：全反式維甲酸、13-順式維甲酸和9-順式維甲酸血藥濃度在1-200?ng/ml范圍內(nèi)，濃度與峰面積比有良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)濃度為0.5?ng/ml。該方法僅適用于全反式維甲酸、13-順式維甲酸和9-順式維甲酸的檢測(cè)，檢測(cè)條件不適用于13-順、9-順、9,13-順的制備液相的分離和純化。

12、美國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)us2676903a公開(kāi)了一種維生素a中間體的萃取方法，該萃取方法探討了現(xiàn)有的脂肪烴族類(lèi)溶劑包括戊烷、己烷、辛烷類(lèi)，例如正戊烷、正庚烷、異庚烷、正己烷和異辛烷、2,2,4-三甲基戊烷(異辛烷)、壬烷、石油醚和環(huán)烷烴(環(huán)己烷)用于萃取工藝輕相；乙腈、硝基甲烷、甲醇、苯胺，硝基甲烷和苯胺混合溶劑，甲醇和乙二醇混合溶劑，乙二醇和乙醇一甲醚混合溶劑作為萃取工藝重相溶劑萃取體系。該萃取體系所用的有機(jī)溶劑價(jià)格高，毒性大，分離難度大。

13、cn111004163a公開(kāi)了一種釕催化劑催化維生素a異構(gòu)化方法，使用釕化合物作為催化劑，在助劑存在下，可以將多種生物活性較低的維生素a順式異構(gòu)體高比例地轉(zhuǎn)化為高生物活性的全反式異構(gòu)體，所述順式異構(gòu)體包括9-順式異構(gòu)體，11-順式異構(gòu)體和13-順式異構(gòu)體。釕是一種稀有元素，儲(chǔ)量有限，價(jià)格高、供應(yīng)不穩(wěn)定。

14、cn103936642a公開(kāi)了一種維生素a母液中異構(gòu)體13順和全反的連續(xù)萃取提純方法，該提純方法是將維生素a母液連續(xù)進(jìn)入正萃塔，經(jīng)低極性溶劑萃取洗滌除去非極性雜質(zhì)，所得重相經(jīng)脫溶劑后進(jìn)入反萃塔，經(jīng)高極性一種或多種醇和水混合溶劑萃取洗滌去極性雜質(zhì)。該方法是提純制備13順異構(gòu)體和全反異構(gòu)體的混合溶液，需要使用大量的有機(jī)試劑，且操作復(fù)雜，不涉及9,13-雙順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體的制備。

15、因13-順式異構(gòu)體、9,13-雙順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體易受光、熱、溶劑、制備方法等因素影響，穩(wěn)定性差，目前維生素a棕櫚酸酯商品化順式異構(gòu)體對(duì)照品難購(gòu)買(mǎi)，也沒(méi)有維生素a棕櫚酸酯順式異構(gòu)體雜質(zhì)對(duì)照品制備方法的相關(guān)專(zhuān)利文獻(xiàn)及非專(zhuān)利文獻(xiàn)，常規(guī)的制備操作耗時(shí)長(zhǎng)，且無(wú)法同時(shí)制備得到含量穩(wěn)定、純度較高的13-順式異構(gòu)體、9,13-雙順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體。因此，有必要探索一種同時(shí)制備維生素a棕櫚酸酯3種順式異構(gòu)體雜質(zhì)對(duì)照品的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種可以同時(shí)制備維生素a棕櫚酸酯3種順式異構(gòu)體雜質(zhì)對(duì)照品的方法，該方法簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)、可操作性強(qiáng)，制備所得維生素a棕櫚酸酯3種順式異構(gòu)體可用于維生素a棕櫚酸酯原料藥及相關(guān)產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)的研究，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素a棕櫚酸酯的順式異構(gòu)體的質(zhì)量控制檢測(cè)，進(jìn)一步提高維生素a棕櫚酸酯及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2、本發(fā)明對(duì)維生素a棕櫚酸酯順式異構(gòu)體雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行了制備研究。制備得到的3種順式雜質(zhì)對(duì)照品經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)確證，順式異構(gòu)體1、2、3分別為13-順式維生素a棕櫚酸酯、9,13-雙順式維生素a棕櫚酸酯、9-順式維生素a棕櫚酸酯；順式異構(gòu)體1、2、3的最大吸收波長(zhǎng)依次為328.0nm、324.0nm、322.0nm，詳見(jiàn)附圖2、附圖5~10。

3、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

4、步驟一、其順式異構(gòu)體產(chǎn)生的破壞條件為：

5、向反應(yīng)瓶中加入正己烷50?ml~100?ml、維生素a棕櫚酸酯5.0?g~10.002?g，加入碘試液0.4?ml~2.0?ml，攪拌反應(yīng)20~30?min，反應(yīng)結(jié)束加入亞硫酸氫鈉0.5?g~3.012?g攪拌將反應(yīng)淬滅。

6、步驟二、維生素a棕櫚酸酯3種順式異構(gòu)體的分離、純化，其色譜條件為：

7、制備液相色譜儀：ssi?prep-2100型制備液相色譜儀。

8、色譜柱：硅膠色譜柱；

9、流速：5.7~6.3?ml/min；

10、紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：325?nm；

11、供試品：步驟一所得的維生素a棕櫚酸酯混合溶液，用正己烷稀釋?zhuān)圆襟E一中維生素a棕櫚酸酯的加入量計(jì)，稀釋后的維生素a棕櫚酸酯濃度為10?mg/ml；

12、進(jìn)樣體積：1.5?ml；

13、流動(dòng)相：正己烷-甲基叔丁基醚=100：0.16~0.22；

14、步驟三、制備過(guò)程：等度洗脫，按出峰先后順序，順式異構(gòu)體分別記為異構(gòu)體1、2、3；使用棕色玻璃容器接取異構(gòu)體1、2、3溶液，密封避光冷凍保存。

15、維生素a棕櫚酸酯3種順式異構(gòu)體溶液的濃縮，其濃縮條件為：

16、異構(gòu)體1、2、3制備溶液分別使用水泵和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在25~30℃，-0.095?mpa下避光旋蒸濃縮，既得異構(gòu)體1、2、3的雜質(zhì)對(duì)照品，濃縮結(jié)束后充氮、密封避光冷凍保存。

17、該方法可用于維生素a棕櫚酸酯順式異構(gòu)體對(duì)照品制備，便于更好的檢測(cè)和利用維生素a類(lèi)產(chǎn)品。

18、維生素a棕櫚酸酯混合溶液進(jìn)行液相監(jiān)控、異構(gòu)體1、2、3的hplc檢測(cè)，色譜條件為：

19、色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

20、流速：1.0?ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：325?nm；柱溫：30℃；等度洗脫；

21、流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(999.5∶0.5)。

22、本發(fā)明的有益效果：

23、1）通過(guò)本技術(shù)方案所用的制備、分離、純化方法操作簡(jiǎn)潔、重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)。制備得到維生素a棕櫚酸酯的3種順式異構(gòu)體：13-順式異構(gòu)體、9,13-雙順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體的純度分別高達(dá)90.87%、87.32%、90.55%，解決了維生素a棕櫚酸酯雜質(zhì)對(duì)照品的供應(yīng)問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素a棕櫚酸酯的順式異構(gòu)體的質(zhì)量控制檢測(cè)，進(jìn)一步提高維生素a棕櫚酸酯及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

24、2）本發(fā)明制備得到的3種順式異構(gòu)體最大吸收波長(zhǎng)與藥典方法一致；藥典方法只能用于定性試驗(yàn)，本發(fā)明得到了3種與藥典方法一致的順式異構(gòu)體雜質(zhì)對(duì)照品，便于定量檢測(cè)維生素a棕櫚酸酯異構(gòu)體含量。

25、3）本發(fā)明分離速度快、洗脫方法簡(jiǎn)單，采用單一流動(dòng)相正己烷-甲基叔丁基醚的體積比為100:0.16-0.22、等度洗脫的純化方法，可快速分離得到維生素a棕櫚酸酯的3種順式異構(gòu)體。

26、4）維生素a棕櫚酸酯順式異構(gòu)體易受光、熱、溶劑等因素影響，穩(wěn)定性差，為保證雜質(zhì)對(duì)照品的穩(wěn)定性，本發(fā)明方法在步驟一反應(yīng)結(jié)束后加入過(guò)量亞硫酸氫鈉攪拌將反應(yīng)淬滅；在制備過(guò)程中充氮?dú)夥€(wěn)定劑，并將制備得到的異構(gòu)體儲(chǔ)存于棕色玻璃容器中，避光冷凍保存。制備得到的維生素a棕櫚酸酯的3種順式異構(gòu)體1、2、3含量穩(wěn)定，純度分別大于等于90.50%、86.00%、90.30%。