本發(fā)明涉及一種魚類脂肪細胞快速分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)成脂方法。

背景技術(shù)：

1、魚肉肉質(zhì)安全，營養(yǎng)豐富，廣受大眾喜愛，其肉質(zhì)營養(yǎng)成分主要包括蛋白質(zhì)、脂肪、水分、灰分等。魚肉的品質(zhì)與脂肪含量息息相關(guān)，魚肉肌內(nèi)脂肪含量增加時，其適口性提升(李銀，2024)。魚類脂肪組織主要沉積于皮下、肌肉、肝臟和腸系膜，根據(jù)種類不同，其沉積部位有所不同。常規(guī)方式通過調(diào)節(jié)魚類飼料配比增加魚類脂肪，這種方式在增加魚肌內(nèi)脂肪的同時會增加腹腔、臟器脂肪，影響魚肉品質(zhì)。然而，研究表明不同部位脂肪沉積機制存在差異，肌內(nèi)脂肪與腹腔脂肪沉積存在差異調(diào)控機制，構(gòu)建腹腔脂肪模型有助于解析腹腔脂肪沉積機制。

2、國內(nèi)外目前已成功構(gòu)建鼠、人、牛、豬等哺乳動物的前體脂肪細胞模型，魚類方面的進展相對緩慢。自20世紀60年代起，魚類的脂肪細胞分離培養(yǎng)技術(shù)也相繼開展起來，包括虹鱒、大西洋鮭(vegusdal?a，2024)、真鯛等。王雅文探究了羅非魚不同部位脂肪組織的差異性，建立了羅非魚脂肪細胞體外培養(yǎng)體系，闡明了羅非魚脂肪細胞的增殖和分化受外源性脂肪的調(diào)控(王雅文，2017)。曹鍇首次進行了草魚脂肪原代及傳代培養(yǎng)的探究，吉紅等深入研究二十二碳六烯酸(dha)、高不飽和脂肪酸(hufa)和花生四烯酸(ara)等在草魚前體脂肪細胞發(fā)育過程中的影響，結(jié)果表明dha處理可顯著抑制脂肪細胞的脂質(zhì)蓄積，而同時抑制β-catenin活性可緩解dha對脂肪細胞脂質(zhì)蓄積的抑制作用(曹鍇，2011)?？轮刃鄣瘸晒⒘嘶|前脂肪細胞系并驗證其經(jīng)油酸誘導(dǎo)后具有分化能力，脂代謝基因表達變化顯著，可作為研究魚類脂肪細胞分化及脂肪沉積的良好模型(柯軼雄，2024)。鯉魚作為我國大宗淡水主要經(jīng)濟魚類，其適應(yīng)性強、生長速度快、產(chǎn)量大、品種多。人類對鯉的要求已經(jīng)由量向質(zhì)改變，尋求肌內(nèi)脂肪高、腹腔脂肪低的優(yōu)質(zhì)鯉魚。常規(guī)通過過度的飼料投喂提升魚肉肌內(nèi)脂肪的方法引起了魚體腹腔脂肪堆積、魚體免疫反應(yīng)、并造成水體污染，構(gòu)建鯉腹腔脂肪細胞培養(yǎng)體系有利于鯉脂肪沉積調(diào)控機制探究，常規(guī)方法培養(yǎng)鯉魚腹腔前脂肪細胞生長慢、數(shù)量少、誘導(dǎo)成脂效率低，構(gòu)建快速高效的培養(yǎng)方法將為解析鯉脂肪細胞的沉積機制提供技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)成脂方法。

2、本發(fā)明鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)方法按照以下步驟進行：

3、一、魚體消毒；

4、二、無菌取腹腔內(nèi)臟團包被脂肪：

5、取腹腔臟器團周脂肪放入含5％-8％體積比的100*青鏈霉素混合液的磷酸鹽緩沖液中清洗3-5次，再用100*青鏈霉素混合液浸泡5min，吸棄液體；

6、三、脂肪組織消化：

7、步驟二得到的脂肪組織置于35mm易持皿包被的細胞培養(yǎng)瓶中，使用胰酶消化脂肪組織，至組織組織粘稠，再加入與胰酶等量體積的胎牛血清終止消化，然后用0.2％?i型膠原酶繼續(xù)消化，加入l15完全培養(yǎng)基終止消化，然后吹打消化液，得到脂肪細胞消化液；所述l15完全培養(yǎng)基按照體積百分數(shù)由13～17％的胎牛血清、0.8～1.2％的l-谷氨酰胺、0.8～1.2％的100*青鏈霉素混合液、0.8～1.2％的鯉魚血清、0.8～1.2％的胚胎提取物和78.2～83.8％的l15基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成；

8、四、制備貼塊及消化細胞：

9、用濾網(wǎng)過濾脂肪組織消化液，取濾網(wǎng)中組織塊直接貼于細胞培養(yǎng)瓶中，收集濾液，1500rpm離心6min，沉淀用l15完全培養(yǎng)基重懸，按50000cells/cm2再接種于上述貼有組織塊的細胞培養(yǎng)瓶中，其中所述細胞培養(yǎng)瓶均預(yù)先使用1％明膠涂布；血清的l15完全培養(yǎng)基為含血清的培養(yǎng)基，按照體積百分數(shù)由13～17％的胎牛血清、0.8～1.2％的l-谷氨酰胺、0.8～1.2％的100*青鏈霉素混合液、0.8～1.2％的鯉魚血清、0.8～1.2％的胚胎提取物和78.2～83.8％的l15基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成；即完成了鯉腹腔前脂肪細胞分離培養(yǎng)。

10、上述分離培養(yǎng)脂肪細胞的誘導(dǎo)成脂方法為：

11、每間隔兩天更換1/3權(quán)利要求1的步驟四的l15完全培養(yǎng)基，脂肪細胞長至80％；然后培養(yǎng)液接種至成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每3天1/2換液，培養(yǎng)7～15天，成功構(gòu)建鯉前脂肪細胞成脂模型；所述成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基由l15完全培養(yǎng)基制成，其中胰島素的濃度為10～20μg/ml、ibmx的濃度為0.4～0.6mmol/l、地塞米松的濃度為1μmol/l、3,3′,5-三碘代-l-甲狀腺原氨的濃度為10nmol/l、油酸亞油酸混合物的濃度為100μmol/l。

12、本發(fā)明的有益效果：

13、本發(fā)明提供了一種通過胰酶與膠原酶組合消化結(jié)合組織塊貼塊的方法高效分離培養(yǎng)出鯉前脂肪細胞的培養(yǎng)模型。

14、本發(fā)明所得細胞操作時間短，可快速增殖成單細胞層，重復(fù)性好，為探究鯉科魚類脂肪沉積機制提供基礎(chǔ)材料。

15、本發(fā)明成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基可使鯉腹腔前脂肪細胞快速且高效成脂，由胰島素、ibmx、地塞米松、3,3′,5-三碘代-l-甲狀腺原氨及油酸混合物組成，所使用的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基可在12-15天誘導(dǎo)70％以上腹腔前脂肪細胞成脂，簡單高效，為構(gòu)建鯉前脂細胞變性模型提供基礎(chǔ)材料。

16、本發(fā)明成功構(gòu)建的鯉腹腔前脂肪細胞模型可為研究調(diào)控脂肪發(fā)育、代謝等生理、病理相關(guān)過程提供優(yōu)質(zhì)工具和方法。

技術(shù)特征：

1.一種鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培方法按照以下步驟進行：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于步驟一中消毒方法：鯉魚用體積比為0.01％的高錳酸鉀溶液浸泡20min，麻醉，抽干血液后，放入75％酒精浸泡1min，進行消毒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于步驟三中細胞培養(yǎng)瓶提前24h包被，用多聚賴氨酸、鼠尾膠原或1％明膠進行包被。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于步驟三中胰酶消化時：每1cm3體積的脂肪組織添加200μl、0.25％胰酶，消化時，將脂肪組織剪至0.1～0.2cm3的小塊，消化1～2min直至組織變粘稠。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于步驟三中加入5倍脂肪組織體積的0.2％i型膠原酶，在28℃消化3.5～4h，消化過程中每半小時充分吹打混勻一次，加入與i型膠原酶等量體積的l15完全培養(yǎng)基終止消化。

6.一種鯉腹腔前脂肪細胞誘導(dǎo)成脂方法，其特征在于該方法以權(quán)利要求1所述腹腔前脂肪細胞進行誘導(dǎo)成脂：

技術(shù)總結(jié)
一種鯉腹腔前脂肪細胞快速分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)成脂方法，本發(fā)明涉及一種魚類脂肪細胞快速分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)成脂方法。分離培養(yǎng)方法：一、魚體消毒；二、無菌取腹腔內(nèi)臟團包被脂肪；三、脂肪組織消化；四、制備貼塊及消化細胞。誘導(dǎo)成脂方法：脂肪前體細胞長至80％后使用含油酸、亞油酸的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3天1/2換液，培養(yǎng)7～15天。本發(fā)明所使用的成脂誘導(dǎo)液在12?15天可使細胞成脂分化70％以上。本發(fā)明鯉腹腔前細胞培養(yǎng)方法細胞生長快可重復(fù)性好，誘導(dǎo)方法成脂效率高，是用于魚類脂肪細胞分化研究的理想方法。

技術(shù)研發(fā)人員：劉天奇,鄭先虎,魯翠云,孫志鵬,張渴新,匡友誼,何立川
受保護的技術(shù)使用者：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26