本發(fā)明屬于南美白對蝦育種，具體涉及一種南美白對蝦raptor基因snp分子標記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、南美白對蝦(litopenaeus?vannamei)，也稱為凡納濱對蝦，因其優(yōu)良的環(huán)境適應(yīng)性和耐受性使其在蝦類人工養(yǎng)殖中脫穎而出，是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一。隨著對蝦養(yǎng)殖水平的不斷提高，養(yǎng)殖密度的不斷加大，投入的飼料量大，養(yǎng)殖代謝產(chǎn)物積累，水交換量少，環(huán)境負荷大，導(dǎo)致水質(zhì)因子波動頻繁，養(yǎng)殖環(huán)境穩(wěn)定性變差，從而影響凡納濱對蝦的生態(tài)養(yǎng)殖。另外由于凡納濱對蝦所投喂的飼料蛋白質(zhì)含量較高，對蝦養(yǎng)殖水體中的氨氮或殘餌、糞便等有機物降解后轉(zhuǎn)化生成亞硝酸鹽的沉積就很多，在養(yǎng)殖水體中的亞硝酸含量升高，水體毒性增加，給南美白對蝦生態(tài)養(yǎng)殖造成一定的困擾。

2、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin,?mtor）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mtor參與調(diào)節(jié)生物體的生長和穩(wěn)態(tài)，是整合營養(yǎng)利用、能量狀態(tài)、細胞應(yīng)激原以及生長因子的信號通路的關(guān)鍵組分。mtor與不同的蛋白結(jié)合形成兩種在結(jié)構(gòu)和功能上迥異的多蛋白復(fù)合體，?mtorcl和mtorc2不論是在上游途徑、下游靶標以及功能上均存在著明顯的差異。而導(dǎo)致兩種mtorc結(jié)構(gòu)和功能上迥異的原因是mtorcl結(jié)合雷帕霉素靶向蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（regulatory-associated?of?mtor，raptor），raptor對mtorc1信號通路的激活起關(guān)鍵作用；而mtorc2結(jié)合雷帕霉素不敏感組分(rapamycin-insensitivecompanion?of?mtor，rictor)。mtorcl能夠響應(yīng)生長因子、氨基酸、能量、壓力、氧氣等的刺激，促進蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸等一系列生物分子的合成，還能夠抑制自噬，促進合成代謝進行的同時抑制分解代謝，它對細胞的多種生物學(xué)過程產(chǎn)生影響。raptor是mtorcl蛋白復(fù)合體的一員，其對整個mtorc?l信號通路至關(guān)重要。raptor與mtor蛋白直接結(jié)合，在mtorcl蛋白復(fù)合體中起到了支架作用，raptor將mtorcl通路下游的效應(yīng)蛋白呈遞給mtor蛋白的催化亞基，促進mtorcl通路的活性，同時raptor能夠感知上游信號并對mtor信號通路進行調(diào)節(jié)。raptor蛋白在mtor信號通路中的作用是非常重要的，其涉及到mtor通路許多能量信號的傳遞。

3、本發(fā)明對mtorcl結(jié)合雷帕霉素靶向蛋白激活過程中起關(guān)鍵作用的蛋白raptor基因核苷酸序列進行耐亞硝氮關(guān)聯(lián)的snps標記篩選，旨在為選育具有耐亞硝酸氮性狀的凡納濱對蝦品種提供技術(shù)支撐，開展凡納濱對蝦抗逆選育，育成并推廣耐亞硝酸鹽新品種，為凡納濱對蝦養(yǎng)殖提供抗逆種質(zhì)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種南美白對蝦raptor基因snp分子標記，將它們作為南美白對蝦耐亞硝氮性狀的功能標記，并且在凡納濱對蝦選育中進行應(yīng)用，培育具有良好耐亞硝氮性狀的凡納濱對蝦品系。

2、本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、一種南美白對蝦raptor基因snp分子標記，其包括分子標記d.11926（a>g）、分子標記d.11999（t>c）、分子標記d.12025（a>g）、分子標記d.12026（a>g）、分子標記d.12039（a>t）、分子標記d.12044（c>t）、分子標記d.12063（a>t）、分子標記d.12195（t>g）、分子標記d.12212（t>a）、分子標記d.12241（g>a）、分子標記d.12349（t>c），并且依次位于序列表的序列1中所示核苷酸序列的第69位、第142位、第168位、第169位、第182位、第187位、第206位、第338位、第355位、第384位、第492位的堿基處。

4、所述分子標記d.11926、分子標記d.11999、分子標記d.12025、分子標記d.12026、分子標記d.12039、分子標記d.12044、分子標記d.12063、分子標記d.12195、分子標記d.12212、分子標記d.12241、分子標記d.12349的多態(tài)性形式依次為a/g、c/t、a/g、a/c、a/t、c/t、a/t、g/t、a/t、a/g、c/t。

5、所述分子標記d.11926的基因型包括aa基因型、ag基因型和gg基因型；

6、所述分子標記d.11999的基因型包括cc基因型、ct基因型和tt基因型；

7、所述分子標記d.12025的基因型包括aa基因型、ag基因型和gg基因型；

8、所述分子標記d.12026的基因型包括aa基因型、ac基因型和cc基因型；

9、所述分子標記d.12039的基因型包括aa基因型、at基因型和tt基因型；

10、所述分子標記d.12044的基因型包括cc基因型和ct基因型；

11、所述分子標記d.12063的基因型包括aa基因型、at基因型和tt基因型；

12、所述分子標記d.12195的基因型包括gt基因型和tt基因型；

13、所述分子標記d.12212的基因型包括aa基因型、at基因型和tt基因型；

14、所述分子標記d.12241的基因型包括aa基因型、ag基因型和gg基因型；

15、所述分子標記d.12349的基因型包括cc基因型、ct基因型和tt基因型。

16、所述南美白對蝦raptor基因snp分子標記的應(yīng)用，將其用于南美白對蝦耐亞硝氮品種的選育，具體是先提取待測南美白對蝦肌肉組織的基因組dna，再將得到的基因組dna作為模板進行pcr擴增和pcr擴增產(chǎn)物純化，然后對得到的pcr擴增產(chǎn)物進行測序，確定所述的分子標記d.11926、分子標記d.11999、分子標記d.12025、分子標記d.12026、分子標記d.12039、分子標記d.12044、分子標記d.12063、分子標記d.12195、分子標記d.12212、分子標記d.12241、分子標記d.12349的基因型；

17、當(dāng)所述分子標記d.11926的基因型為優(yōu)勢基因型的aa基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

18、當(dāng)所述分子標記d.11999的基因型為優(yōu)勢基因型的tt基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

19、當(dāng)所述分子標記d.12025的基因型為優(yōu)勢基因型的aa基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

20、當(dāng)所述分子標記d.12026的基因型為優(yōu)勢基因型的aa基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

21、當(dāng)所述分子標記d.12039的基因型為優(yōu)勢基因型的aa基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

22、當(dāng)所述分子標記d.12044的基因型為優(yōu)勢基因型的cc基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

23、當(dāng)所述分子標記d.12063的基因型為優(yōu)勢基因型的aa基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

24、當(dāng)所述分子標記d.12195的基因型為優(yōu)勢基因型的tt基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

25、當(dāng)所述分子標記d.12212的基因型為優(yōu)勢基因型的aa基因型或at基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

26、當(dāng)所述分子標記d.12241的基因型為優(yōu)勢基因型的gg基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種；

27、當(dāng)所述分子標記d.12349的基因型為優(yōu)勢基因型的tt基因型時，選擇該個體作為后備親本進行南美白對蝦品種育種。

28、本發(fā)明通過檢測群體中的個體raptor基因snp標記位點處的基因型，保留有利基因型的個體，淘汰不利基因型的個體，來提高南美白對蝦耐亞硝氮的能力。

29、進一步的，所述pcr擴增的過程中，用于檢測所述南美白對蝦raptor基因snp分子標記的引物包括引物f1、引物r1、引物r2；

30、所述引物f1的核苷酸序列為：tctggagaggtgaggttatgg（如序列表中序列2所示）；

31、所述引物r1的核苷酸序列為：gcatccctggtatatttgttctca（如序列表中序列3所示）；

32、所述引物r2的核苷酸序列為：catagactgtgatgtaactgtcag（如序列表序列4所示）。

33、進一步的，所述pcr擴增過程為巢式pcr擴增，其中進行兩次pcr擴增，第一次pcr的擴增體系包括5?μl的2×es?taq?mastemix、0.2μl的濃度為100ng/μl?的模板，0.4μl的濃度為10μmol/l的引物f1、0.4μl的濃度為10μmol/l的引物r1和4μl的ddh2o；第二次pcr的擴增體系包括25?μl的2×es?taq?mastemix、1μl的稀釋100倍的第一次pcr擴增的產(chǎn)物，2μl的濃度為10μmol/l的引物f1、2μl的濃度為10μmol/l的引物r2、20μl的ddh2o。

34、進一步的，所述第一次pcr擴增的擴增程序為：

35、s101：94℃下預(yù)變性5min；

36、s102：94℃下變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35個擴增循環(huán)；

37、s103：72℃后延伸7min；

38、所述第二次pcr的擴增程序為：

39、s201：94℃下預(yù)變性3min；

40、s202：94℃下變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；

41、s203：72℃后延伸7min。

42、本技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下有益效果：

43、1、本發(fā)明提供了一種與南美白對蝦耐亞硝氮性狀相關(guān)聯(lián)的raptor基因snp分子標記，所述的11個snp位點中有3個snp位點與南美白對蝦耐亞硝氮性狀具有極顯著的相關(guān)性、8個snp位點與南美白對蝦耐亞硝氮性狀顯著相關(guān)，可選取其中4個snp位點可作為taggersnp。

44、2、將本發(fā)明提供的raptor基因snp分子標記應(yīng)用到耐亞硝氮南美白對蝦選育，可不受月齡、性別影響，也無需進行大規(guī)模亞硝氮脅迫實驗即可準確篩選獲得耐亞硝氮個體作為后備親本逐級培育，實現(xiàn)分子輔助南美白對蝦耐亞硝氮性狀的選育，顯著提高育種效率和準確性并促進育種進程，為南美白對蝦耐亞硝氮品種改良研究提供良好的基礎(chǔ)。