本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,具體涉及一種敲除肺炎克雷伯菌 ycic基因的λred兩步同源重組法。
背景技術(shù):
1、碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant klebsiella?pneumoniae,crkp)的出現(xiàn)給臨床治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。多粘菌素作為“最后一線“抗生素被重新啟用。但是近年來(lái)隨著多粘菌素被大量運(yùn)用,crkp對(duì)多粘菌素的耐藥率呈上升趨勢(shì),多粘菌素耐藥crkp血流感染的全因死亡率極高,在一些報(bào)告中達(dá)到50%以上,這給患者生命安全造成了新的威脅。在之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)多粘菌素耐藥crkp中出現(xiàn)了較為頻繁的 ycic變異。 ycic編碼一種新的gtp環(huán)化水解酶,假定其作為金屬伴侶起作用,目前尚不清楚 ycic蛋白的具體作用機(jī)制。
2、2000年,有學(xué)者研發(fā)出一種利用λ噬菌體同源重組系統(tǒng)在大腸桿菌中來(lái)實(shí)現(xiàn)外源線性雙鏈dna與染色體dna同源序列之間發(fā)生重組的方法。在實(shí)際的操作中,三種red蛋白(gam、exo、beta)的基因被放置在表達(dá)載體上,一旦外源dsdna電轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞時(shí),便有概率在同基因組靶標(biāo)序列發(fā)生同源重組,替換掉要敲除的基因。
3、λred兩步同源重組法是預(yù)先將具有red重組酶的質(zhì)粒pacbsr-hyg導(dǎo)入目的菌株,然后以pkd4和目的菌株dna為模板,合成pcr基因打靶片段產(chǎn)物,該片段包含卡那霉素耐藥基因盒,兩端含有翻轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點(diǎn)(flippase?recognition?target,frt),500bp左右的目的基因同源序列。將該打靶片段電轉(zhuǎn)入含pacbsr-hyg質(zhì)粒的目的菌株,在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下,pacbsr-hyg質(zhì)粒編碼的red重組酶得以表達(dá),導(dǎo)入細(xì)菌的線性打靶dna片段與染色體的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組。目的基因被抗性基因取代。然后再將pflp-hyg質(zhì)粒導(dǎo)入重組菌株,其表達(dá)的flp翻轉(zhuǎn)酶可以與frt位點(diǎn)結(jié)合,消除抗性基因片段,在42℃上培養(yǎng)24h以上,去除pflp-hyg質(zhì)粒,目的基因即得到敲除。
4、與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比,λred兩步同源重組法操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短、應(yīng)用范圍廣,在該試驗(yàn)中,延長(zhǎng)同源臂長(zhǎng)度至500bp,顯著提高了基因敲除的成功率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種敲除肺炎克雷伯菌 ycic基因的λred兩步同源重組法。
2、敲除肺炎克雷伯菌 ycic的打靶序列,包括 ycicl-f和 ycicl-r,kan-f和kan-r, ycicr-f和 ycicr-r;其中, ycicl-f為seq?id?no.1, ycicl-r為seq?id?no.2;kan-f為seq?idno.3,kan-r為seq?id?no.4; ycicr-f為seq?id?no.5, ycicr-r為seq?id?no.6。
3、一種敲除肺炎克雷伯菌 ycic的的λred兩步同源重組法,包括如下步驟:
4、(1)預(yù)先將具有red重組酶的質(zhì)粒pacbsr-hyg導(dǎo)入目的菌株;
5、(2)將所述的敲除肺炎克雷伯菌 ycic基因的 ycicl-f和 ycicl-r,kan-f和kan-r, ycicr-f和 ycicr-r融合pcr得到基因打靶片段產(chǎn)物,該片段包含卡那霉素耐藥基因盒,兩端含有翻轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點(diǎn)(flippase?recognition?target,frt),500bp左右的目的基因同源序列;
6、(3)將該打靶片段電轉(zhuǎn)入含pacbsr-hyg質(zhì)粒的目的菌株,在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下,pacbsr-hyg質(zhì)粒編碼的red重組酶得以表達(dá),導(dǎo)入細(xì)菌的線性打靶dna片段與染色體的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組,目的基因被抗性基因取代;然后再將pflp-hyg質(zhì)粒導(dǎo)入重組菌株,其表達(dá)的flp翻轉(zhuǎn)酶與frt位點(diǎn)結(jié)合,消除抗性基因片段,在42℃上培養(yǎng)24h以上,去除pflp-hyg質(zhì)粒,目的基因即得到敲除。
7、所述的λred兩步同源重組的應(yīng)用,用于靶向敲除肺炎克雷伯菌 ycic基因。
8、本發(fā)明的有益效果如下:
9、本發(fā)明公開了一種敲除肺炎克雷伯菌基因的λred兩步同源重組法應(yīng)用,本發(fā)明使用三種質(zhì)粒,一種是同源重組質(zhì)粒pacbsr-hyg,其阿拉伯糖啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下控制red重組酶的基因表達(dá)。另一種質(zhì)粒pkd4-kan其含有卡那霉素耐藥因盒,用作抗性基因盒的pcr模板,最后一種質(zhì)粒為抗性基因消除質(zhì)粒pflp-hyg其含有重組酶,用于消除染色體上同源重組的抗性基因。能敲除肺炎克雷伯菌 ycic基因,從而有利于闡明 ycic的具體功能。
10、本發(fā)明的λred兩步同源重組法靶向敲除肺炎克雷伯菌 ycic基因的系統(tǒng),可以有效的敲除菌株的 ycic基因,特異性高,方法簡(jiǎn)單,易于推廣。
1.敲除肺炎克雷伯菌ycic的打靶序列,其特征在于,包括ycicl-f和ycicl-r,kan-f和kan-r,ycicr-f和ycicr-r;其中,ycicl-f為seq?id?no.1,ycicl-r為seq?id?no.2;kan-f為seq?id?no.3,kan-r為seq?id?no.4;ycicr-f為seq?id?no.5,ycicr-r為seq?id?no.6。
2.一種敲除肺炎克雷伯菌ycic的的λred兩步同源重組法,其特征在于,包括如下步驟:
3.一種如權(quán)利要求1所述的λred兩步同源重組的應(yīng)用,其特征在于,用于靶向敲除肺炎克雷伯菌ycic基因。