本發(fā)明屬于植物分子育種與基因編輯，尤其涉及一種油菜bnac3.leafy早花分子標(biāo)記及其在育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、甘藍(lán)型油菜(brassica?napus,aacc,2n＝38)，是中國(guó)與世界范圍內(nèi)栽培的重要油料作物，由白菜型油菜(brassica?rapa)與甘藍(lán)(brassica?oleracea)自然雜交并經(jīng)基因組加倍形成異源四倍體，因此甘藍(lán)型油菜(后簡(jiǎn)稱(chēng)油菜)有著非常豐富的遺傳變異基礎(chǔ)。越冬甘藍(lán)型油菜產(chǎn)區(qū)主要采用“油稻”或者“油稻稻”的輪作制度進(jìn)行一年多熟制生產(chǎn)，以確保糧油供給安全。近年來(lái)隨著水稻生育期的不斷延長(zhǎng)與“油-稻-稻”三熟制的推廣，適應(yīng)茬口早花早熟油菜的種質(zhì)需求不斷增加。目前，大多數(shù)種植的油菜生育期較長(zhǎng)，油菜與水稻換茬存在茬口矛盾，影響水稻的種植；同時(shí)，過(guò)長(zhǎng)的生育期容易讓油菜后期遭遇極端不利天氣，如高溫逼熟等，最終影響產(chǎn)量。理解環(huán)境條件變化對(duì)生殖過(guò)渡和花序發(fā)育啟動(dòng)的影響，對(duì)于油菜生殖適應(yīng)至關(guān)重要。對(duì)于大多數(shù)植物如一年生擬南芥，提早生殖過(guò)渡和花序的建立可以縮短生命周期，減少受極端天氣影響的可能性。對(duì)于作物來(lái)說(shuō)，生命周期的長(zhǎng)短是一個(gè)更加復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，作物感知環(huán)境條件，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，在合適的時(shí)間進(jìn)入生殖生長(zhǎng)，啟動(dòng)花序建立并開(kāi)花，體現(xiàn)了油菜對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐上，早花早熟油菜種質(zhì)需具備花序建立早、開(kāi)花早等特征。

2、在基因組中，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide?polymorphisms,snps)和小插入或缺失(small?insertions?or?deletions,indels)的片段是廣泛存在的基因組結(jié)構(gòu)變異類(lèi)型，促進(jìn)了自然群體中許多重要農(nóng)藝性狀的分化。隨著二代基因組測(cè)序與組裝技術(shù)的發(fā)展，基于snp的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wideassociation?study,gwas)在各種研究中被用來(lái)檢測(cè)許多與表型相關(guān)的基因組位點(diǎn)。以開(kāi)花時(shí)間為例，許多研究報(bào)道擬南芥floweringlocus?t(ft)和floweringlocus?c(flc)的同源基因在甘藍(lán)型油菜中存在多個(gè)snp，這些snp與其生態(tài)型的分化和開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控密切相關(guān)。與snps和indels相比，結(jié)構(gòu)變異(structural?variations,svs)因其變異范圍更大，往往大于50到100個(gè)堿基(basepair，bp)，甚至達(dá)到幾十千bp，對(duì)染色體上編碼區(qū)和順式調(diào)控區(qū)的干擾更大，基因結(jié)構(gòu)變異包括大片段序列的存在和缺失變異(presence?and?absence?variations,pavs)、重復(fù)(duplications,dups)和倒位(inversions,invs)等類(lèi)型。這些基因結(jié)構(gòu)變異對(duì)植物進(jìn)化和農(nóng)藝性狀的遺傳決定有著更深遠(yuǎn)的影響；然而受限于測(cè)序技術(shù)，基因結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)必須依賴(lài)長(zhǎng)鏈測(cè)序進(jìn)行，因此研究者對(duì)基因結(jié)構(gòu)變異與基因型與表型的理解也起始于此。在全基因組范圍內(nèi)，大多數(shù)與基因相關(guān)的基因結(jié)構(gòu)變異定位于順式調(diào)控區(qū)(cis-regulatoryregion)，只有少部分存在于編碼序列區(qū)域(coding?sequence,cds)。外顯子上的基因結(jié)構(gòu)變異通常導(dǎo)致基因表達(dá)抑制，而存在于啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域的sv對(duì)基因表達(dá)的影響更為多樣，可以起到促進(jìn)或抑制基因表達(dá)的功能。在甘藍(lán)型油菜中，bnaa10.flc在春性和冬性生態(tài)型中表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)變異。在春性材料westar中，bnaa10.flc的編碼區(qū)插入一個(gè)5,625個(gè)堿基的line類(lèi)型反向轉(zhuǎn)座子(te)，導(dǎo)致幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。在冬性材料darmor和tapidor中，啟動(dòng)子區(qū)插入一個(gè)621個(gè)堿基的mite型轉(zhuǎn)座子，增強(qiáng)了bnaa10.flc的表達(dá)，從而延遲了開(kāi)花時(shí)間(yin,s.,wan,m.,guo,c.,wang,b.,li,h.,li,g.,tian,y.,ge,x.,king,g.j.,liu,k.,et?al.(2020).transposon?insertions?within?alleles?ofbnaflc.a10?andbnaflc.a2?are?associated?with?seasonal?crop?type?in?rapeseed.j?exp?bot?71:4729-4741.)。在基因組更加復(fù)雜的異源四倍體甘藍(lán)型油菜中，基因結(jié)構(gòu)變異與表型關(guān)聯(lián)的研究還相對(duì)較少，其如何影響油菜花序建立時(shí)間與開(kāi)花時(shí)間，有待于進(jìn)一步的探索。

3、在擬南芥中，生殖發(fā)育啟動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子如磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding?protein，pebp)家族蛋白已被廣泛研究。ft促進(jìn)生殖過(guò)程，而terminalflower?1(tfl1)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。ft和tfl1的snps、indels和sv形式的變異已廣泛存在于多種作物中，決定了它們的開(kāi)花時(shí)間。在擬南芥(arabidopsis?thaliana，at)的生殖過(guò)程中，atleafy(atlfy)作為一個(gè)先鋒轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)上調(diào)apetala1(atap1)來(lái)確定花分生組織，atap1又通過(guò)正反饋機(jī)制正向調(diào)控atlfy表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)atlfy對(duì)atft和attfl1起到不同的調(diào)控作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)株型和開(kāi)花的精確調(diào)控。近期研究發(fā)現(xiàn)atlfy處于atft和attfl1相反的調(diào)控之下(zhu,y.,klasfeld,s.,jeong,c.w.,jin,r.,goto,k.,yamaguchi,n.,and?wagner,d.(2020).terminal?flower?1-fd?complex?target?genesand?competition?with?flowering?locus?t.nat?commun11:5118.)。

4、隨著crispr/cas9技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因編輯候選基因位點(diǎn)敲除一個(gè)基因，可以驗(yàn)證該基因是否真正控制某些性狀。而目前所使用的crispr/cas9基本將sgrna靶點(diǎn)靶標(biāo)于基因編碼區(qū)域，以求改變編碼蛋白的氨基酸序列，達(dá)到基因功能確實(shí)的目的。而在全基因組尺度上，基因結(jié)構(gòu)變異的分布大多位于非編碼區(qū)，比如基因內(nèi)部的內(nèi)含子區(qū)域，或者基因與基因之間的區(qū)域。通過(guò)對(duì)改變非編碼區(qū)的基因序列，可以上調(diào)或下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)量，而不改其編碼的蛋白序列。在甘藍(lán)型油菜的研究中，如何利用非編碼區(qū)域來(lái)調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)量，進(jìn)而改變植株性狀，還有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)甘藍(lán)型核心種質(zhì)資源的基因組上大片段的基因結(jié)構(gòu)變異分析，挖掘影響花序形成早晚的遺傳位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，并通過(guò)基因編輯技術(shù)驗(yàn)證該片段的遺傳和分子功能，創(chuàng)制了新的遺傳序列，定向改變了花序形成早晚的農(nóng)藝性狀，為油菜種質(zhì)性狀的改良提供良好的策略。

2、本發(fā)明提供了一種甘藍(lán)型油菜bnac3.leafy基因的結(jié)構(gòu)變異序列del00110133，所述基因結(jié)構(gòu)變異序列del00110133如seq?id?no.1所示。

3、本發(fā)明提供了所述的基因結(jié)構(gòu)變異序列del00110133在促進(jìn)油菜bnac3.leafy基因的表達(dá)、促進(jìn)油菜早開(kāi)花或縮短油菜生育期中的應(yīng)用，在油菜bnac3.leafy基因的非編碼區(qū)導(dǎo)入所述的基因結(jié)構(gòu)變異序列del00110133，油菜bnac3.leafy基因表達(dá)量提高，油菜表現(xiàn)為早花表型，縮短油菜的生育期。

4、本發(fā)明提供了一種甘藍(lán)型油菜bnac3.leafy早花分子標(biāo)記，包括bnac3.leafy_del00110133_f和bnac3.leafy_del00110133_r；所述bnac3.leafy_del00110133_f的序列如seq?id?no.2所示，所述bnac3.leafy_del00110133_r的序列如seq?id?no.3所示。

5、本發(fā)明提供了一種篩選具有早花表型的油菜種質(zhì)的方法，包括以下步驟：

6、1)提取待篩選樣品的基因組dna；

7、2)用所述的油菜bnac3.leafy早花分子標(biāo)記為引物，對(duì)步驟1)獲得的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；若擴(kuò)增產(chǎn)物包括所述的基因結(jié)構(gòu)變異序列del00110133則確定為具有早花表型的油菜種質(zhì)；否則，確定為不具有早花表型的油菜種質(zhì)。

8、優(yōu)選的，步驟2)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2508bp。

9、本發(fā)明提供了一種用于制備油菜晚花遺傳序列的sgrna，包括sgrna-2、sgrna-26或sgrna-31；所述sgrna-2的序列如seq?id?no.4所示，所述sgrna-26的序列如seq?id?no.5所示，所述sgrna-31的序列如seq?id?no.6所示。

10、本發(fā)明提供了所述的sgrna在降低bnac3.leafy基因的表達(dá)量、制備油菜晚花遺傳序列或延長(zhǎng)油菜生育期中的應(yīng)用，利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)使bnac3.leafy基因第二內(nèi)含子序列缺失，獲得油菜晚花遺傳序列，降低bnac3.leafy基因的表達(dá)量，延長(zhǎng)油菜的生育期。

11、本發(fā)明提供了一種油菜晚花遺傳序列，所述序列如seq?id?no.7或seq?id?no.8所示。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

13、本發(fā)明采用種植在大田的甘藍(lán)型油菜核心種質(zhì)資源進(jìn)行早花性狀與基因結(jié)構(gòu)變異的對(duì)應(yīng)關(guān)系研究，本發(fā)明采用的自然群體遺傳多樣性好，能夠代表不同生態(tài)型油菜的各種農(nóng)藝性狀。本發(fā)明通過(guò)基于基因組結(jié)構(gòu)變異的全基因組分析，獲得了影響花序建成早花的遺傳位點(diǎn)，并獲得了對(duì)應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)變異。針對(duì)其中一個(gè)在c3染色體上的bnac3.leafy基因，在該基因的第二個(gè)內(nèi)含子非編碼區(qū)域存在基因結(jié)構(gòu)變異序列del00110133，存在該基因結(jié)構(gòu)變異序列有利于基因的高表達(dá)，并與大田種植材料的早花表型吻合。

14、本發(fā)明針對(duì)上述基因結(jié)構(gòu)變異序列del00110133，進(jìn)行了分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，獲得的分子標(biāo)記能夠用于篩選甘藍(lán)型油菜不同種質(zhì)資源中具有花序建立早、開(kāi)花時(shí)間早性狀的種質(zhì)或植株，應(yīng)用于后續(xù)油菜快速育種。

15、本發(fā)明還針對(duì)該基因結(jié)構(gòu)變異序列del00110133進(jìn)行了基于crispr/cas9的遺傳序列編輯，該方法能夠制備獲得新的晚花遺傳序列，為花序建立遲、開(kāi)花時(shí)間晚的甘藍(lán)型油菜育種提供新的方法以及新的基因序列資源。