本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物，具體涉及一種黃曲霉毒素b1降解酶及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著全球人口的增長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，糧食安全問(wèn)題日益受到各國(guó)政府和國(guó)際組織的關(guān)注。然而糧食生產(chǎn)過(guò)程中真菌毒素的污染已成為制約糧食安全的一個(gè)重要因素。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（fao）報(bào)告全球每年約有25%糧食受到真菌毒素污染，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元。同時(shí)，為全面貫徹落實(shí)我國(guó)糧食安全戰(zhàn)略，保障經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定持續(xù)增長(zhǎng)，對(duì)糧食中真菌毒素污染治理迫在眉睫。

2、污染糧食的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和赭曲霉毒素等，其中黃曲霉毒素b1?(afb1)污染最為嚴(yán)重，毒性最強(qiáng)，具有致癌性，在1993年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（iarc）列為一級(jí)致癌物。

3、目前已經(jīng)有超過(guò)100個(gè)國(guó)家和地區(qū)對(duì)食品和飼料中afb1含量制定了最高限量標(biāo)準(zhǔn)。中國(guó)關(guān)于食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)—gb?2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?食品中真菌毒素限量》包括6大類和16小類食品，afb1限量范圍為0.5μg/kg~20μg/kg。2006年歐盟規(guī)定黃曲霉毒素最高限量值在0.1μg/kg~12μg/kg之間。中國(guó)飼料中afb1的限量標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)gb13078-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)飼料原料和飼料產(chǎn)品2大類13小類制訂了afb1限量要求，最高限制含量在10μg/kg~50μg/kg之間。

4、生物技術(shù)具有綠色高效、專一、無(wú)二次污染的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為脫除糧食中?afb1污染的研究熱點(diǎn)。生物酶法降解afb1對(duì)減少因真菌毒素污染造成的糧食損失，保障糧食數(shù)量安全和質(zhì)量安全具有十分重要的意義。

5、公開(kāi)號(hào)為cn118256459a，名稱為一種重組酶及其在降解黃曲霉毒素b1中的應(yīng)用的發(fā)明專利公開(kāi)了一種重組酶，可降解afb1。但是上述技術(shù)方案中afb1的降解率在最優(yōu)條件下僅可達(dá)到60%左右。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供一種黃曲霉毒素b1降解酶及制備方法和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)使用降解酶高效降解黃曲霉毒素b1的目的。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種黃曲霉毒素b1降解酶，其核苷酸序列如seq?idno.1所示。

3、可選的，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4、可選的，所述黃曲霉毒素b1降解酶在ph為7~10，溫度為20~60℃下使用。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種黃曲霉毒素b1降解酶的制備方法，包括以下步驟：

6、s1、合成黃曲霉毒素b1降解酶編碼基因，并連接到pet-21a的bamhi和xhoi酶切位點(diǎn)之間；

7、s2、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞bl21(de3)，經(jīng)amp抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證和測(cè)序，確定獲得正確的重組菌株；

8、s3、將所述重組菌株接種于?lb培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得菌液，將菌液轉(zhuǎn)接于lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入iptg誘導(dǎo)，得發(fā)酵液；

9、s4、將發(fā)酵液離心得到的菌體重懸，再次離心、洗滌得到的菌體再次重懸，超聲后離心，收集上清液，使用鎳離子親和層析柱純化，得到黃曲霉毒素b1降解酶。

10、可選的，s3中重組菌株接種于?lb培養(yǎng)液中培養(yǎng)的條件是溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為180rpm；，時(shí)間為11~13h；菌液轉(zhuǎn)接于?lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件是溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為180rpm，時(shí)間為2~3h。

11、可選的，所述菌液轉(zhuǎn)接于lb培養(yǎng)基時(shí)菌液為lb培養(yǎng)基重量的1%；所述iptg的終濃度為1mmol/l，所述誘導(dǎo)的時(shí)間為15~17h

12、可選的，s4中離心時(shí)溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為12000rpm，時(shí)間為10~30min。

13、可選的，s4中重懸使用ph為7.0磷酸緩沖液。

14、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供將黃曲霉毒素b1降解酶應(yīng)用于飼料添加劑。

15、可選的，所述飼料添加劑為液體制劑。

16、本發(fā)明的上述技術(shù)方案至少包括以下有益效果：

17、本發(fā)明提供的黃曲霉毒素b1降解酶豐富了黃曲霉毒素b1降解酶的類型，黃曲霉毒素b1降解率可高達(dá)90%以上，高效的降解黃曲霉毒素b1，提高了黃曲霉毒素b1降解酶的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.?一種黃曲霉毒素b1降解酶，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素b1降解酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq?idno.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素b1降解酶，其特征在于，所述黃曲霉毒素b1降解酶在降解黃曲霉毒素b1時(shí)的ph為7~10，溫度為20~60℃。

4.一種如權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素b1降解酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素b1降解酶的制備方法，其特征在于，s3中重組菌株接種于?lb培養(yǎng)液中培養(yǎng)的條件是溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為180rpm；，時(shí)間為11~13h；菌液轉(zhuǎn)接于lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件是溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為180rpm，時(shí)間為2~3h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素b1降解酶的制備方法，其特征在于，所述菌液轉(zhuǎn)接于lb培養(yǎng)基時(shí)菌液為lb培養(yǎng)基重量的1%；所述iptg的終濃度為1mmol/l，所述誘導(dǎo)的時(shí)間為15~17h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素b1降解酶的制備方法，其特征在于，s4中離心時(shí)溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為12000rpm，時(shí)間為10~30min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素b1降解酶的制備方法，其特征在于，s4中重懸使用ph為7.0磷酸緩沖液。

9.一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的黃曲霉毒素b1降解酶應(yīng)用于飼料添加劑。

10.如權(quán)利要求9所述的黃曲霉毒素b1降解酶應(yīng)用于飼料添加劑，其特征在于，所述飼料添加劑為液體制劑。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種黃曲霉毒素B<subgt;1</subgt;降解酶及制備方法和應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，包括其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明提供一種黃曲霉毒素B<subgt;1</subgt;降解酶及制備方法和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)使用新型降解酶高效降解黃曲霉毒素B<subgt;1</subgt;的目的。

技術(shù)研發(fā)人員：鄭瑞,鄭德潤(rùn),鄭文革,鄭鴻潤(rùn),焦江濤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河南億萬(wàn)中元生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30