本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種固定化脂肪酶的制備方法及其在提高固定化脂肪酶的催化活性和/或穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、脂肪酶是一類(lèi)水解酶，能夠在環(huán)境友好的條件下催化裂解酯鍵。由于成本低、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，脂肪酶在食品加工、環(huán)境修復(fù)、有機(jī)合成、生物燃料和藥品生產(chǎn)等重要工業(yè)領(lǐng)域具有巨大的潛力。脂肪酶的熱穩(wěn)定性取決于其獨(dú)特的“蓋子”構(gòu)象，即活性中心(ser-his-asp催化三聯(lián)體)埋在一個(gè)可移動(dòng)的α-螺旋“蓋子”覆蓋的疏水口袋中，這個(gè)“蓋子”可以保護(hù)活性中心免受外界的損耗，然而，它不可避免地限制了被埋藏的活性中心的可及性，影響脂肪酶發(fā)揮催化活性。因此，如何解決脂肪酶的催化活性與穩(wěn)定性的矛盾是本領(lǐng)域技術(shù)人員重點(diǎn)攻克的難題。

2、固定化脂肪酶是通過(guò)物理或化學(xué)的方法將單體的游離脂肪酶與載體固定結(jié)合的復(fù)合脂肪酶催化劑。納米材料是固定化脂肪酶常用的載體，通過(guò)設(shè)置一個(gè)“盔甲”來(lái)穩(wěn)定脂肪酶的整體構(gòu)象，并且脂肪酶和納米材料之間的界面相互作用提供了將“蓋子”調(diào)節(jié)成適合用途的構(gòu)象的可能性。

3、現(xiàn)有技術(shù)中已有通過(guò)納米載體來(lái)獲得高活性和高穩(wěn)定性的固定化脂肪酶的方法，例如，將脂肪酶固定在石墨烯表面，通過(guò)脂肪酶與石墨烯之間的分子相互作用來(lái)調(diào)節(jié)脂肪酶構(gòu)象。然而，由于脂肪酶被固定在石墨烯的表面，導(dǎo)致脂肪酶的大部分結(jié)構(gòu)域仍然暴露在外部環(huán)境中，導(dǎo)致表面固定化的脂肪酶容易被浸出，催化穩(wěn)定性不理想，難以循環(huán)使用?，F(xiàn)有技術(shù)中還有基于網(wǎng)狀化學(xué)設(shè)計(jì)納米孔的方法，將脂肪酶包裹在納米孔中，通過(guò)特定的主-客體相互作用介導(dǎo)被捕獲的脂肪酶進(jìn)入開(kāi)蓋構(gòu)象，雖然這種納米孔策略為激活脂肪酶提供了新的思路，但仍面臨較多挑戰(zhàn)：(1)由于納米孔與脂肪酶的尺寸匹配問(wèn)題，必須仔細(xì)設(shè)計(jì)納米孔的幾何和化學(xué)結(jié)構(gòu)才能容納體積龐大的脂肪酶；(2)脂肪酶界面激活不確定性問(wèn)題：通常脂肪酶通過(guò)與納米孔的界面激活作用從而使蓋子打開(kāi)，獲得高活性的脂肪酶。然而，這種界面激活作用需要某些特定的孔道修飾，并且這種孔道微環(huán)境限制了脂肪酶高活性的研究；(3)合成步驟復(fù)雜，由于被包裹在納米孔中的脂肪酶的取向難以預(yù)測(cè)，需要反復(fù)進(jìn)行大量調(diào)試。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中缺少更加簡(jiǎn)便地制備催化活性高且穩(wěn)定性高的固定化脂肪酶的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種固定化脂肪酶的制備方法及其在提高固定化脂肪酶的催化活性和/或穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種固定化脂肪酶的制備方法。

3、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供根據(jù)所述的制備方法制得的固定化脂肪酶。

4、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述固定化脂肪酶作為催化劑的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的制備方法在提高脂肪酶的穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述的制備方法在提高脂肪酶的催化活性中的應(yīng)用。

7、本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供所述的制備方法在提高固定化脂肪酶的催化活性和/或穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

8、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下方案予以實(shí)現(xiàn)的：

9、本發(fā)明克服了以往納米孔方法孔隙設(shè)計(jì)復(fù)雜的局限性，解決了大尺寸脂肪酶限域困難的問(wèn)題，而且規(guī)避了脂肪酶界面激活的不確定性問(wèn)題，通過(guò)將有機(jī)溶劑誘導(dǎo)脂肪酶聚集自激活成開(kāi)蓋構(gòu)象，預(yù)先獲得高活性的脂肪酶，然后通過(guò)原位封裝的方法，在脂肪酶的表面促發(fā)成核，在二維金屬有機(jī)框架(mof)內(nèi)快速鎖定脂肪酶的開(kāi)蓋構(gòu)象，二維mof的長(zhǎng)程有序孔道能架起內(nèi)部脂肪酶聚集物與外部催化底物之間的橋梁，將脂肪酶限域在mof孔道內(nèi)，使鎖定的脂肪酶聚集高度可達(dá)，具有顯著高于比游離脂肪酶的生物催化活性和穩(wěn)定性。

10、本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)一種固定化脂肪酶的制備方法，包括以下步驟：將脂肪酶溶液、鋅鹽和有機(jī)配體在弱堿性條件下進(jìn)行配位反應(yīng)，得到固定化脂肪酶；

11、所述脂肪酶溶液為包含脂肪酶的丙醇溶液，其中，所述脂肪酶和丙醇的質(zhì)量體積比為(5～20)mg：0.8ml；所述脂肪酶、zn2+和所述有機(jī)配體的摩爾比為3.375：(0.5～4)：1。

12、丙醇的化學(xué)式為c?ho，有兩種同分異構(gòu)體：正丙醇和異丙醇。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，正丙醇和異丙醇均能誘導(dǎo)脂肪酶聚集自激活成開(kāi)蓋構(gòu)象。具體的，所述脂肪酶溶液為通過(guò)將所述脂肪酶溶于正丙醇溶液或異丙醇溶液中得到。

13、優(yōu)選地，所述丙醇溶液中，丙醇與水的體積比為(0.025～4)：1。

14、更優(yōu)選地，所述丙醇溶液中，丙醇與水的體積比為4：1。

15、優(yōu)選地，所述丙醇為正丙醇。

16、優(yōu)選地，所述脂肪酶和所述丙醇的質(zhì)量體積比為10mg：0.8ml。

17、優(yōu)選地，所述脂肪酶、zn2+和所述有機(jī)配體的摩爾比為3.375：(0.5～4)：1。

18、更優(yōu)選地，所述脂肪酶、zn2+和所述有機(jī)配體的摩爾比為3.375：2：1。

19、鋅鹽指含有鋅元素的鹽類(lèi)化合物，為合成mof提供必需的zn2+，包括但不限于氧化鋅、乙酸鋅和硝酸鋅，均能用于本發(fā)明通過(guò)原位生成法的用二維mof框架快速封裝開(kāi)蓋構(gòu)象的脂肪酶。

20、優(yōu)選地，所述鋅鹽為硝酸鋅。

21、優(yōu)選地，弱堿性條件包括ph為10～11。

22、優(yōu)選地，所述制備方法包括以下步驟：將所述脂肪酶溶液、有機(jī)配體溶液和弱堿性的鋅鹽溶液進(jìn)行配位反應(yīng)，得到固定化脂肪酶；所述有機(jī)配體溶液為包含所述有機(jī)配體的乙醇溶液；所述鋅鹽溶液為包含鋅鹽的水溶液。

23、更優(yōu)選地，所述乙醇溶液中，乙醇和水的體積比為(2～4)：1。

24、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述乙醇溶液中，乙醇和水的體積比為3：1。

25、更優(yōu)選地，所述鋅鹽溶液的ph為10～11。

26、優(yōu)選地，所述制備方法還包括純化所得固定化脂肪酶。

27、更優(yōu)選地，所述純化的方法包括固液分離和洗滌。

28、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述純化的方法包括離心、洗滌和干燥。

29、更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述洗滌的方法包括以下步驟：用水或乙醇洗滌離心所得沉淀物。

30、更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述干燥的方法包括真空干燥。

31、優(yōu)選地，所述脂肪酶為lipozyme?tl?100l。

32、具體的，所述制備方法還包括以下步驟：

33、s1.將脂肪酶以終濃度為(5～20)mg/ml溶于正丙醇溶液(水：正丙醇＝1：(0.025～4)，v/v)或異丙醇溶液(水：異丙醇＝1：(0.025～4)，v/v)中得到脂肪酶溶液，將hhtp以終濃度為10mm溶于乙醇溶液(水：乙醇＝1：(2～4)，v/v)中得到有機(jī)配體溶液，用naoh調(diào)節(jié)zn2+濃度為(0.004～0.032)mmol的硝酸鋅水溶液的ph至10～11得到鋅鹽溶液；

34、s2.將步驟s1所得所述脂肪酶溶、所述有機(jī)配體溶液和所述鋅鹽溶液混勻后充分靜置；

35、s3.將步驟s2所得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離心，收集沉淀物，之后依次用水和乙醇充分洗滌所述沉淀物，再經(jīng)過(guò)充分干燥，即得。

36、根據(jù)任一所述的制備方法制得的固定化脂肪酶也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

37、所述固定化脂肪酶作為催化劑的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

38、優(yōu)選地，所述催化劑用于催化水解反應(yīng)和/或酯化反應(yīng)。

39、更優(yōu)選地，所述水解反應(yīng)的底物包括對(duì)硝基苯丁酸酯。

40、更優(yōu)選地，所述酯化反應(yīng)的底物包括油酸和脂肪醇。

41、優(yōu)選地，所述催化劑為非均相催化劑。

42、一種催化劑，包括所述固定化脂肪酶。

43、任一所述的制備方法在提高脂肪酶的穩(wěn)定性中的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

44、任一所述的制備方法在提高脂肪酶的催化活性中的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

45、任一所述的制備方法在提高固定化脂肪酶的催化活性和/或穩(wěn)定性中的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

46、優(yōu)選地，所述催化活性包括催化水解反應(yīng)和/或酯化反應(yīng)的活性。

47、更優(yōu)選地，所述水解反應(yīng)的底物包括對(duì)硝基苯丁酸酯。

48、更優(yōu)選地，所述酯化反應(yīng)的底物包括油酸和脂肪醇。

49、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述脂肪醇的碳原子數(shù)為5～18。

50、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

51、本發(fā)明通過(guò)直接的聚集構(gòu)象鎖定策略，實(shí)現(xiàn)一步合成脂肪酶@mof的生物復(fù)合材料，與傳統(tǒng)的溶劑熱法、噴霧逐層液相外延法和相變法相比，該方法操作更加簡(jiǎn)便，且在溫和條件下結(jié)晶，使脂肪酶固定化，對(duì)脂肪酶的影響更小，具有顯著優(yōu)于天然游離脂肪酶的強(qiáng)大生物催化活性以及優(yōu)異的穩(wěn)定性，能多次重復(fù)循環(huán)利用，在工業(yè)化生產(chǎn)中大規(guī)模利用脂肪酶生物催化反應(yīng)中具有重要的推廣應(yīng)用價(jià)值。