本發(fā)明屬于卵母細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地，涉及一種l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、l-天冬氨酸(l-asp)是一種有機化合物，化學(xué)式為c4h7no4。白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，味微酸。氨基酸是用于體外培養(yǎng)人類受精卵至囊胚階段的培養(yǎng)液的必需成分。使用此類培養(yǎng)液可顯著提高移植到子宮后植入的胚胎比例，并減少需要移植才能懷孕的胚胎數(shù)量。

2、研究發(fā)現(xiàn)，特定氨基酸在豬[1]、鼠[2]、山羊[3]和牛[4]的卵母細胞成熟過程中發(fā)揮著作用。例如，卵泡天冬氨酸濃度已被證明與人類卵母細胞形態(tài)的改善、中期ii(mii)卵母細胞的增加和受精率直接相關(guān)[5]。bahrami等人報道稱，含有谷氨酰胺、脯氨酸和異亮氨酸的特定培養(yǎng)液可用于牛卵母細胞成熟和成功受精[6]。半胱氨酸單獨或與谷氨酸和甘氨酸結(jié)合使用，可提高卵母細胞和卵丘細胞中的谷胱甘肽水平，從而促進發(fā)育谷氨酰胺已被證明能促進卵母細胞核成熟，并在葡萄糖或乳酸存在的情況下誘導(dǎo)卵丘擴張[7]。卵母細胞和胚胎的質(zhì)量與氨基酸代謝有關(guān)[8]。研究表明，發(fā)育不良的卵母細胞表現(xiàn)出更高的谷氨酰胺消耗水平、更高的丙氨酸合成水平和更低的總氨基酸消耗水平[9]。以上研究表明氨基酸在提高母畜繁殖性能發(fā)揮重要作用，但l-asp在對促進山羊卵母細胞成熟方面的研究未見系統(tǒng)報道。

3、本發(fā)明研究結(jié)果表明，l-asp能降低山羊卵母細胞ros水平，增加線粒體活性，提高卵母細胞成熟率。因此，本發(fā)明提供了一種由l-asp與山羊卵母細胞培養(yǎng)液組成的新培養(yǎng)液，用于提高山羊卵母細胞成熟率。為了深入、系統(tǒng)研究l-asp對山羊卵母細胞成熟的影響機制，本發(fā)明團隊擬在現(xiàn)有工作基礎(chǔ)上，綜合利用細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的方法，開展l-asp對提高山羊卵母細胞成熟率的分子機制進行研究，以期為提高山羊卵母細胞成熟率培養(yǎng)液的開發(fā)提供理論依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用。制備的山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液可以提高山羊卵母細胞體外成熟率，即l-天冬氨酸在促進山羊卵母細胞體外成熟的應(yīng)用，從而實現(xiàn)改善山羊卵母細胞質(zhì)量。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、本發(fā)明所述的一種l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用，所述山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液由l-天冬氨酸溶液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成。

4、進一步地，所述l-天冬氨酸溶液是將l-天冬酸粉末用山羊胚胎水(sigma，w1503)加熱至55℃充分溶解而得。

5、進一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液是由20％發(fā)情山羊血清，0.5iu/ml?fsh，0.5iu/ml?lh，1μg/ml雌二醇，1mm丙酮酸鈉，0.05mm?l-半胱氨酸，1％?its，20ng/ml?egf和25μg/ml慶大霉素的tcm-199制備而成。

6、進一步地，所述山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液的l-天冬氨酸溶液的終濃度為0.5-2.5mm。

7、更進一步地，所述山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液的l-天冬氨酸溶液的終濃度為2.0mm。

8、本發(fā)明所述的一種l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用，經(jīng)過如下步驟：

9、s1，將l-天冬氨酸粉末，用胚胎水加熱55℃進行充分溶解，得l-天冬氨酸溶液，備用；

10、s2，取上述步驟所得l-天冬氨酸溶液，加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中搖勻，使形成l-asp終濃度為2.0mm的山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液；

11、s3，將上述步驟s2所得的山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液，用移液器加入到四孔板中并覆蓋石蠟油放在38.5℃、5％co2、100％濕度培養(yǎng)箱預(yù)熱一定時間后將完整且致密的卵丘團的卵母細胞放在提前預(yù)熱好的添加山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液的四孔板中并置于38.5℃、5％co2、100％濕度培養(yǎng)箱進行體外成熟培養(yǎng)；

12、s4，用移液器將培養(yǎng)22h后的卵母細胞吸出放入3.5cm培養(yǎng)皿中并加入1ml1％的透明質(zhì)酸酶反復(fù)吹打多次，除去卵母細胞周圍的顆粒細胞，在體視顯微鏡下挑出排出第一極體的成熟卵母細胞(第一極體位于透明帶和卵母細胞膜之間)，將成熟的卵母細胞放回成熟液中，并統(tǒng)計卵母細胞成熟情況。

13、本發(fā)明所述的l-天冬氨酸在制備促進山羊卵母細胞體外成熟藥物制劑中的應(yīng)用。

14、進步一地，所述藥物制劑包含2.0mm的l-天冬氨酸。

15、進步一地，所述藥物制劑包含但不限于：注射劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、本發(fā)明添加2.0mm的l-天冬氨酸的山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液，山羊卵母細胞體外成熟率為76.66％±4.07％，較空白對照組(59.57％±4.16％)，成熟率上升了17.09％。降低了山羊卵母細胞ros水平，增加了線粒體活性，顯著提升了山羊卵母細胞體外成熟卵子率。且大部分的卵丘細胞擴張也顯著變好。

技術(shù)特征：

1.一種l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用。

2.如權(quán)利要求1所述l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用，其特征在于，所述山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液由l-天冬氨酸溶液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成。

3.如權(quán)利要求2所述l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用，其特征在于，所述l-天冬氨酸溶液是將l-天冬酸粉末用胚胎水加熱至55℃充分溶解而得。

4.如權(quán)利要求2所述l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液是由20％發(fā)情山羊血清，0.5iu/ml?fsh，0.5iu/ml?lh，1μg/ml雌二醇，1mm丙酮酸鈉，0.05mm?l-半胱氨酸，1％its，20ng/ml?egf和25μg/ml慶大霉素的tcm-199制備而成。

5.如權(quán)利要求2所述l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用，其特征在于，所述山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液的l-天冬氨酸溶液的終濃度為0.5-2.5mm。

6.如權(quán)利要求5所述l-天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用，其特征在于，所述山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液的l-天冬氨酸溶液的終濃度為2.0mm。

7.如權(quán)利要求1-6任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，經(jīng)過如下步驟：

8.一種如權(quán)利要求1所述的l-天冬氨酸在制備促進山羊卵母細胞體外成熟藥物制劑中的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求8所述的l-天冬氨酸在制備促進山羊卵母細胞體外成熟藥物制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑包含2.0mm的l-天冬氨酸。

10.如權(quán)利要求8或9任一項所述的l-天冬氨酸在制備促進山羊卵母細胞體外成熟藥物制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑包含但不限于：注射劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種L?天冬氨酸在制備山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中的應(yīng)用。本發(fā)明所述山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液由一定量的L?天冬氨酸和基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成。經(jīng)驗證在添加了L?Asp的山羊卵母細胞培養(yǎng)液L?Asp能降低山羊卵母細胞ROS水平，增加線粒體膜電位活性，顯著提高了卵母細胞成熟率。本發(fā)明所述的L?Asp還可用于在制備成促進山羊卵母細胞體外成熟藥物制劑。本發(fā)明公開的含L?Asp的山羊卵母細胞體外培養(yǎng)液及其應(yīng)用對提高山羊體外胚胎的生長發(fā)育具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：陳祥,王清未,曹茂盛,汪艷妃,李鵬程,季全
受保護的技術(shù)使用者：貴州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23