(一)本發(fā)明屬于生物，特別涉及一種提高種子外源蛋白表達(dá)量的方法。

背景技術(shù)：

0、(二)背景技術(shù)

1、在植物細(xì)胞中生產(chǎn)具有重要價(jià)值重組蛋白具有生產(chǎn)成本低、周期短、容易規(guī)模化、產(chǎn)能彈性大等優(yōu)點(diǎn)，植物生物反應(yīng)器的研究和應(yīng)用一直是生物產(chǎn)業(yè)的熱點(diǎn)。種子胚乳組織成分簡(jiǎn)單、沒有復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物、容易貯藏等特點(diǎn)，水稻、玉米和大豆等多種植物種子已被成功用于生產(chǎn)多種重組醫(yī)用、藥用或工業(yè)用蛋白。雖然前期生產(chǎn)成本低，但是植物源重組蛋白提取和純化的成本難以壓縮，如果表達(dá)量不夠高就不具備提取純化價(jià)值。外源蛋白表達(dá)量決定了植物生物反應(yīng)器是否具有產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值，當(dāng)前已經(jīng)有多種重組蛋白成功在種子中表達(dá)，如纖維素酶、漆酶、胰蛋白酶、乳鐵蛋白、溶解酶、植酸酶、抗菌肽、血清白蛋白等眾多蛋白成功在種子中表達(dá)，但僅有部分高表達(dá)的蛋白滿足產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的要求，進(jìn)入到產(chǎn)業(yè)開發(fā)階段。提高重組蛋白的表達(dá)量是植物生物反應(yīng)器應(yīng)用迫切需要解決的關(guān)鍵問題。

2、植物種子被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)重組蛋白，重組蛋白在種子中積累后，在干燥狀態(tài)下收獲和存儲(chǔ)有助于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這些特性使得種子是重組蛋白生產(chǎn)、保存的理想平臺(tái)，方便后續(xù)的加工和應(yīng)用。提高植物種子中外源蛋白表達(dá)量是降低重組蛋白生產(chǎn)成本最為直接的辦法。目前已經(jīng)有多種提高外源蛋白表達(dá)量的方法和策略應(yīng)用于植物生物反應(yīng)器中，比如篩選適宜的啟動(dòng)子、終止子或增強(qiáng)表達(dá)的調(diào)控元件，優(yōu)化密碼子，優(yōu)化蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲(chǔ)等策略(蔣銘軒等，生物技術(shù)通報(bào)，2023,39(11)：110-122)。通過抑制植物中蛋白酶表達(dá)，減少外源蛋白降解是有效提高外源蛋白表達(dá)量和產(chǎn)量的方法(鄒奇，中國(guó)生物工程雜志，2023,43(1)：71-86)。種子中總蛋白含量相對(duì)穩(wěn)定，外源蛋白表達(dá)量提高空間相對(duì)有限。比如玉米種子中一般總蛋白含量在10％左右，其中醇溶蛋白含量大于60％，現(xiàn)有的研究顯示，抑制醇溶蛋白的表達(dá)并不會(huì)導(dǎo)致玉米籽粒蛋白總量大幅度降低，而是通過蛋白質(zhì)再平衡導(dǎo)致其它部分蛋白含量提高。因?yàn)閯?dòng)物對(duì)醇溶蛋白的消耗和吸收效果不好，該策略一般用于改良玉米蛋白品質(zhì)，但是并不是種子中其他蛋白表達(dá)量都能夠得到提高(wu，frontplant?sci,2014,30(5)240,pmid:24910639)。因?yàn)橛衩状既艿鞍拙哂斜磉_(dá)量高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，也有研究通過將醇溶蛋白和外源蛋白融合來提高外源蛋白的表達(dá)量和穩(wěn)定性，但是尚未見到通過抑制玉米醇溶蛋白表達(dá)來提高重組蛋白表達(dá)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、(三)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一種提高種子外源蛋白表達(dá)量的方法，所述方法通過抑制醇溶蛋白表達(dá)減少內(nèi)源蛋白合成，實(shí)現(xiàn)在種子中外源重組蛋白高表達(dá)，降低重組蛋白生產(chǎn)成本。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一種提高種子外源蛋白表達(dá)量的方法，所述方法包括抑制植物種子中醇溶蛋白的表達(dá)，同時(shí)特異性表達(dá)外源蛋白，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高表達(dá)和積累。

4、進(jìn)一步，所述醇溶蛋白包括19kda和22kda的玉米醇溶蛋白。

5、進(jìn)一步，本發(fā)明提供的抑制方法包含但不限于rna干擾、基因編輯技術(shù)。優(yōu)選根據(jù)玉米醇溶蛋白基因家族中高度同源序列設(shè)計(jì)rna干擾序列，優(yōu)選seq?id?no：2中912-1718bp所示。

6、進(jìn)一步，用于抑制玉米醇溶蛋白表達(dá)的表達(dá)框包括啟動(dòng)子，rna干擾序列和終止子。所述啟動(dòng)子包括但不限于種子特異啟動(dòng)子，優(yōu)選水稻谷蛋白啟動(dòng)子，如seq?id?no：2中1-911bp所示；所述rna干擾序列優(yōu)選seq?id?no：2中912-1718bp所示；所述終止子可以是常用基因表達(dá)框的一般終止子，優(yōu)選seq?id?no：2中1719-1796bp所示。

7、進(jìn)一步，優(yōu)選用于抑制玉米醇溶蛋白表達(dá)的表達(dá)框核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

8、進(jìn)一步，用于特異性表達(dá)外源蛋白的表達(dá)框包括特異性啟動(dòng)子、外源蛋白編碼基因、終止子；所述特異性啟動(dòng)子為水稻谷蛋白啟動(dòng)子、玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子等能夠在種子中特異性表達(dá)外源蛋白的啟動(dòng)子，優(yōu)選水稻谷蛋白啟動(dòng)子，核苷酸序列如seq?no.3中1-983bp所示。所述外源蛋白包括但不限于需要規(guī)模生產(chǎn)的工業(yè)、醫(yī)用或飼用蛋白，本發(fā)明選擇重組脂肪酶，核苷酸序列如seq?no.3中984-1935bp所示。所述終止子為可以是常用基因表達(dá)框的一般終止子，優(yōu)選seq?id?no：3中1936-2424bp所示。

9、進(jìn)一步，用于特異性表達(dá)外源蛋白的表達(dá)框核苷酸序列如seq?id?no：3所示。

10、進(jìn)一步，所述方法包括構(gòu)建篩選標(biāo)記基因表達(dá)框，所述篩選標(biāo)記基因可以是耐草甘膦、耐草銨膦或耐潮霉素等能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選出來的標(biāo)記基因，優(yōu)選耐草甘膦表達(dá)框，核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

11、進(jìn)一步，所述方法包括如下步驟：(1)構(gòu)建含用于抑制玉米醇溶蛋白表達(dá)的表達(dá)框和篩選標(biāo)記基因表達(dá)框的植物轉(zhuǎn)化載體，將植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入植物基因組中，篩選獲得玉米醇溶蛋白低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物；(2)構(gòu)建含用于特異性表達(dá)外源蛋白的表達(dá)框和篩選標(biāo)記基因表達(dá)框的植物轉(zhuǎn)化載體，將植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入植物基因組中，篩選獲得外源蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物；(3)將步驟(1)和步驟(2)篩選的轉(zhuǎn)基因植物雜交，篩選得到醇溶蛋白低表達(dá)且外源蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。

12、進(jìn)一步，步驟(1)和(2)中用于構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體的基礎(chǔ)載體為是將基礎(chǔ)載體pcambia1300(ncbi序列編號(hào)af234296)，hindiii/xhoi雙酶切去除pcambia1300載體中潮霉素基因后的雙元載體。植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入植物基因組的方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一種通過抑制醇溶蛋白表達(dá)且特異性表達(dá)外源蛋白的方法，能夠大幅度提高外源重組蛋白在植物種子中表達(dá)量，解決了現(xiàn)有方法利用植物種子生產(chǎn)重組蛋白產(chǎn)量低的問題，提高植物生物反應(yīng)器的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為在種子中規(guī)?；统杀旧a(chǎn)重組蛋白提供了新的選擇。

技術(shù)特征：

1.一種提高種子外源蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，所述方法包括抑制植物種子中醇溶蛋白的表達(dá)，同時(shí)特異性表達(dá)外源蛋白，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高表達(dá)和積累。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇溶蛋白包括19kda和22kda的玉米醇溶蛋白。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制的方法包含rna干擾、基因編輯技術(shù)。

4.如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，抑制植物種子中醇溶蛋白表達(dá)的rna干擾序列如seq?id?no：2中912-1718bp所示。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，用于抑制醇溶蛋白表達(dá)的表達(dá)框包括啟動(dòng)子，rna干擾序列和終止子，表達(dá)框核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)構(gòu)建含用于抑制玉米醇溶蛋白表達(dá)的表達(dá)框和篩選標(biāo)記基因表達(dá)框的植物轉(zhuǎn)化載體，將植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入植物基因組中，篩選獲得玉米醇溶蛋白低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物；(2)構(gòu)建含用于特異性表達(dá)外源蛋白的表達(dá)框和篩選標(biāo)記基因表達(dá)框的植物轉(zhuǎn)化載體，將植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入植物基因組中，篩選獲得外源蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物；(3)將步驟(1)和步驟(2)篩選的轉(zhuǎn)基因植物雜交，篩選得到醇溶蛋白低表達(dá)且外源蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種提高種子外源蛋白表達(dá)量的方法，所述方法包括抑制植物種子中醇溶蛋白的表達(dá)，同時(shí)特異性表達(dá)外源蛋白，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高表達(dá)和積累。本發(fā)明方法能夠大幅度提高外源重組蛋白在植物種子中表達(dá)量，解決了現(xiàn)有方法利用植物種子生產(chǎn)重組蛋白產(chǎn)量低的問題，提高植物生物反應(yīng)器的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為在種子中規(guī)模化低成本生產(chǎn)重組蛋白提供了新的選擇。

技術(shù)研發(fā)人員：林朝陽(yáng),佘明君,何逸洋,趙宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23