本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種利用kindlin-2高表達體系構(gòu)建腫瘤類器官的方法。

背景技術(shù)：

1、腫瘤類器官代表了從肺癌患者的組織樣本中直接繁殖的腫瘤細胞的三維培養(yǎng)。這些類器官是在精確的條件下培養(yǎng)出來的，這些條件保留了組織結(jié)構(gòu)、遺傳變異和對藥物的敏感性，與原始腫瘤中發(fā)現(xiàn)的相似。這些來自患者的模型作為一種快速篩選前瞻性治療方法的系統(tǒng)，為科學(xué)家提供了在與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的實際腫瘤非常相似的模型中測試新藥療效和安全性的手段。此外，腫瘤類器官包含了腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的多種細胞群，這對于研究疾病進化的基本機制和耐藥性的出現(xiàn)至關(guān)重要。通過分析來自患者的腫瘤類器官的遺傳和分子特征，研究人員可以識別預(yù)測治療反應(yīng)或預(yù)后的生物標志物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開了利用kindlin-2高表達體系構(gòu)建腫瘤類器官的方法，構(gòu)建患者來源的腫瘤器官的方法。本發(fā)明在患者來源的腫瘤細胞、基質(zhì)干細胞或者腫瘤相關(guān)的成纖維細胞中高表達kindlin-2蛋白，進而促進腫瘤器官的構(gòu)建模型，特別是對于那些常規(guī)方法難以構(gòu)建的類器官。利用kindlin-2高表達體系構(gòu)建腫瘤類器官將代表一種有價值的前期臨床工具，用于研究腫瘤演進的機理，并推進精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種利用kindlin-2高表達體系構(gòu)建腫瘤類器官的方法，包括以下步驟：

3、s1：將獲得的腫瘤組織進行剪碎后加入膠原蛋白酶進行水解，過篩后得到細胞懸液；

4、s2:?將細胞懸液進行離心，吸去上清液后保留腫瘤細胞沉淀物，用kindlin-2病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞、基質(zhì)干細胞和腫瘤相關(guān)成纖維細胞中的一種，獲得高表達kindlin-2的腫瘤細胞沉淀物；

5、s3：將高表達kindlin-2的腫瘤細胞沉淀物與基質(zhì)膠按照設(shè)定的比例進行混勻，得到混合液，且將混合液置于冰上；

6、s4：將混合液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)板中，凝固后加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后得到腫瘤類器官。

7、作為優(yōu)選，在步驟s1中，所獲取的腫瘤組織的的來源為癌變組織，包括肺癌、食管癌、甲狀腺癌、胰腺癌、舌癌、胃癌、肝癌、腸癌、乳腺癌、肉瘤、鼻咽癌、卵巢癌以及宮頸癌組織中的一種。

8、作為優(yōu)選，kindlin-2高表達體系包括慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體工具中的一種。

9、作為優(yōu)選，在步驟s1中，將組織剪碎至0.5-2?mm3?的細小碎片或糊糜狀，加入10ml膠原蛋白水解酶置入37℃細胞培養(yǎng)箱消化30分鐘；然后加入完全培養(yǎng)基終止消化，使用70-100目細胞篩過濾消化后的組織獲得細胞懸液。

10、作為優(yōu)選，在步驟s2中，當在基質(zhì)干細胞或腫瘤相關(guān)成纖維細胞中高表達kindlin-2，則需要按照將高表達kindlin-2的基質(zhì)干細胞或者腫瘤相關(guān)成纖維細胞再與腫瘤細胞按照一定比例混合，這個比例一般為高表達kindlin-2的基質(zhì)干細胞或者腫瘤相關(guān)成纖維細胞占總細胞數(shù)的比例30%-60%。

11、作為優(yōu)選，在步驟s3中，將腫瘤細胞沉淀物用pbs進行清洗，然后按照每孔8千至1萬個細胞對應(yīng)10-30μl基質(zhì)膠的比例計算所需要加入的類器官類基質(zhì)膠。

12、作為優(yōu)選，在步驟s4中，用移液器吸取基質(zhì)膠和細胞的混合液移至細胞培養(yǎng)孔板中，混合懸液點至培養(yǎng)孔底部，其鋪開后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁；將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中凝固30分鐘，待基質(zhì)膠凝固至不再流動后，沿孔壁緩緩加入培養(yǎng)基，每3-4天更換一次培養(yǎng)基，最后得到腫瘤類器官。

13、作為優(yōu)選，培養(yǎng)基包含以下試劑：培養(yǎng)基含有10μmol的y-27632-hcl，?10%胎牛血清；培養(yǎng)基配制好并在4?℃下保存不超過7天。

14、?作為優(yōu)選，基質(zhì)膠包含matrigel、cultrex?bme、collagen、gelatin及其他合成基質(zhì)膠。

15、本申請的有益之處在于：本申請利用kindlin-2構(gòu)建高表達體系，參與整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，并作為細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)通路之間的橋梁；kindlin-2在肺成纖維細胞的激活和肺纖維化的進展中起著關(guān)鍵作用。kindlin-2對于活化成纖維細胞和肌成纖維細胞的黏著斑和應(yīng)力纖維的增強和發(fā)展都是必需的。kindlin-2的增加，還與胃癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫抑制狀況有關(guān)。kindlin-2既在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種癌種的腫瘤細胞中廣泛高表達；又在腫瘤間質(zhì)細胞如腫瘤相關(guān)成纖維細胞，基質(zhì)干細胞中高表達。本發(fā)明構(gòu)建的類器官可用于分析人腫瘤類器官的生物學(xué)特征；還以腫瘤類器官為模型工具建立了預(yù)測臨床腫瘤藥物敏感性平臺，更加系統(tǒng)全面地評估治療方案的有效性，并為腫瘤患者篩選最適最優(yōu)的個體化精準治療方案提供支持。

技術(shù)特征：

1.一種利用kindlin-2高表達體系構(gòu)建腫瘤類器官的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟s1中，所獲取的腫瘤組織的來源為癌變組織，所述腫瘤包括肺癌、食管癌、甲狀腺癌、胰腺癌、舌癌、胃癌、肝癌、腸癌、乳腺癌、肉瘤、鼻咽癌、卵巢癌以及宮頸癌中一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，kindlin-2高表達體系包括慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體工具中的一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟s1中，將組織剪碎至0.5-2?mm3?的細小碎片或糊糜狀，加入10ml膠原蛋白水解酶置入37℃細胞培養(yǎng)箱消化30分鐘；然后加入完全培養(yǎng)基終止消化，使用70-100目細胞篩過濾消化后的組織獲得細胞懸液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟s2中，當在基質(zhì)干細胞或腫瘤相關(guān)成纖維細胞中高表達kindlin-2，則需要按照將高表達kindlin-2的基質(zhì)干細胞或者腫瘤相關(guān)成纖維細胞再與腫瘤細胞按照一定比例混合，這個比例一般為高表達kindlin-2的基質(zhì)干細胞或者腫瘤相關(guān)成纖維細胞占總細胞數(shù)的比例30%-60%。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟s3中，將腫瘤細胞沉淀物用pbs進行清洗，然后按照每孔8千至1萬個細胞對應(yīng)10-30ul基質(zhì)膠的比例計算所需要加入的類器官類基質(zhì)膠。

7.根據(jù)權(quán)利要1所述的方法，其特征在于，在步驟s4中，用移液器吸取基質(zhì)膠和細胞的混合液移至細胞培養(yǎng)孔板中，混合懸液點至培養(yǎng)孔底部，其鋪開后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁；將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中凝固30分鐘，待基質(zhì)膠凝固至不再流動后，沿孔壁緩緩加入培養(yǎng)基，每3-4天更換一次培養(yǎng)基，最后得到腫瘤類器官。

8.根據(jù)權(quán)利要1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基包含以下試劑：培養(yǎng)基含有10μmol的y-27632-hcl，?10%胎牛血清；培養(yǎng)基配制好并在4℃下保存不超過7天。

9.根據(jù)權(quán)利要1所述的方法，其特征在于，基質(zhì)膠包含?matrigel、cultrex?bme、collagen、gelatin及其他合成基質(zhì)膠。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種利用kindlin?2高表達體系構(gòu)建腫瘤類器官的方法，包括以下步驟：S1:將獲得的腫瘤組織進行剪碎；后加入膠原蛋白酶進行水解，過篩后得到細胞懸液；S2:將細胞懸液進行離心，吸去上清液后保留腫瘤細胞沉淀物，用kindlin?2病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，高表達kindlin?2蛋白；S3：將高表達kindlin?2的腫瘤細胞與基質(zhì)膠按照設(shè)定的比例進行混勻，得到混合液，且將混合液置于冰上；S4:將混合液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)板中，凝固后加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后得到腫瘤類器官。本發(fā)明在腫瘤細胞、基質(zhì)干細胞或者腫瘤相關(guān)的成纖維細胞中高表達kindlin?2蛋白，進而促進腫瘤器官的構(gòu)建模型，特別是對于那些常規(guī)方法難以構(gòu)建的類器官，利用kindlin?2高表達體系構(gòu)建腫瘤類器官將代表一種有價值的前期臨床工具，用于研究腫瘤演進的機理。

技術(shù)研發(fā)人員：郭玲,于振濤,隋志林,王家鑫,王瀟瀟
受保護的技術(shù)使用者：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23