本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種用于同時檢測皮膚軟組織感染相關病原體及其耐藥基因的引物探針組合物、試劑盒及檢測方法。

背景技術：

1、皮膚軟組織感染(skin?and?soft?tissue?infections，ssti)，是化膿性致病菌侵犯表皮、真皮和皮下組織引起的炎癥性疾病，包括一大類涉及皮膚、皮下脂肪、筋膜層及肌肉層的感染壞死性疾病。此類疾病病情輕重程度變化很大，可以是輕度淺表局限性感染，也可以是威脅生命的深部壞死性軟組織感染，其治療及預后因ssti的分類、分級不同而有所不同。

2、目前對于ssti尚無統(tǒng)一的分類標準，在臨床上主要根據(jù)患者的病因、發(fā)病部位及病情輕重大致分為淺表皮膚細菌性感染、繼發(fā)性ssti及壞死性軟組織感染3類。其中，淺表皮膚細菌性感染：包括毛囊炎、癤、癰、膿皰病、蜂窩織炎、丹毒和化膿性汗腺炎等。繼發(fā)性ssti：包括手術切口感染、創(chuàng)傷感染、燒傷感染、咬傷感染、感染性囊腫及膿腫、糖尿病足潰瘍及壓瘡感染等。壞死性軟組織感染：是指病變累及皮膚及深層結(jié)構，特點是皮膚、皮下組織、筋膜或骨骼肌壞死，此類型相對少見，確診較難，但病情發(fā)展迅速，病死率很高，可達30％。

3、ssti本身不會傳染，但部分細菌、病毒及真菌感染者，這些病原體可通過直接接觸、間接接觸、呼吸道、性接觸、母嬰垂直等方式進行傳播。ssti可并發(fā)菌血癥、膿毒血癥、感染性休克、淋巴結(jié)炎、肺炎、急性腎功能衰竭、多器官功能障礙綜合征(mods)等。

4、當患者出現(xiàn)皮膚及軟組織發(fā)紅、腫脹、皮溫升高、疼痛等癥狀時，需及時就醫(yī)。醫(yī)生會對患者進行體格檢查，以及血常規(guī)、血生化、病原學檢查、尿常規(guī)、血沉檢查、血清學檢查、病理活檢等檢查。病原學檢查為細菌診斷的金標準，包括致病菌的培養(yǎng)、分離及藥敏試驗等。對于淺表皮膚細菌性感染可不作為常規(guī)檢查，但對于病程遷延、反復發(fā)作或抗菌藥物治療無效的ssti患者，應進行病原學檢查，以力爭早期明確致病菌，并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果指導進一步治療。

5、輕度ssti患者使用外用抗生素治療，主要應用于淺表皮膚細菌性感染，如毛囊炎、膿皰病及復發(fā)性癤病等。外用抗生素直接作用于皮膚靶部位，在局部停留時間長，對表皮或真皮淺層感染治療效果較好，但缺點是容易出現(xiàn)抗生素耐藥。常用的外用抗生素有莫匹羅星軟膏、桿菌肽軟膏、瑞他莫林軟膏等。通常來講，輕癥的ssti患者可采取口服用藥，嚴重感染者則需靜脈給藥。醫(yī)生會根據(jù)患者的一般情況、感染部位、合并癥、臨床表現(xiàn)及分級情況等綜合考慮，有針對性地選擇抗菌藥物進行全身治療，并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選用敏感抗生素治療。常用的藥物包括青霉素、克林霉素、頭孢唑林、頭孢氨芐、哌拉西林他唑巴坦、頭孢哌酮舒巴坦、美羅培南、亞胺培南、慶大霉素、妥布霉素、萬古霉素等。

6、目前因抗生素的濫用，導致出現(xiàn)細菌耐藥性增強的現(xiàn)象。而耐藥細菌的感染是ssti患者治療失敗和死亡率增加的主要原因，嚴重威脅人類生命健康。因此，在常規(guī)診斷中，診斷皮膚軟組織感染的致病病原體類型的同時，更重要的是同時診斷其耐藥性的檢測，如此醫(yī)生才能給出更合理有效的治療方案。

7、因此，現(xiàn)有技術有待進一步改進。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明提供了一種可同時檢測皮膚軟組織感染相關病原體及其耐藥基因的引物探針組合物、試劑盒及檢測方法，該引物探針組合物及其試劑盒不僅能實現(xiàn)對8種皮膚軟組織感染相關病原體的檢測，并且同時對這些病原體的耐藥基因進行同步檢測，檢測效率高、特異性強，極大地提高了工作效率。

2、為解決上述問題，本技術提供以下技術方案：

3、第一方面，本技術還提供一種用于同時檢測皮膚軟組織感染相關病原體及其耐藥基因的引物探針組合物，其包括針對大腸桿菌ybbj基因、肺炎克雷伯氏菌mgrb基因、金黃色葡萄球菌msrb基因、無乳鏈球菌pg-mutase基因、乙型溶血性鏈球菌is3基因、伯克霍爾德氏菌16s?rrna基因、產(chǎn)氣莢膜梭菌spaa基因、諾卡菌seca1基因以及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因、甲氧西林耐藥基因、碳青霉烯酶耐藥基因和萬古霉素耐藥基因的引物探針組合物，

4、用于檢測大腸桿菌ybbj基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.1所示的上游引物ybbj-f、序列如seq?id?no.2所示的下游引物ybbj-r以及序列如seq?id?no.3所示的熒光探針ybbj-p；

5、用于檢測肺炎克雷伯氏菌mgrb基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.4所示的上游引物mgrb-f、序列如seq?id?no.5所示的下游引物mgrb-r以及序列如seq?id?no.6所示的熒光探針mgrb-p；

6、用于檢測金黃色葡萄球菌msrb基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.7所示的上游引物msrb-f、序列如seq?id?no.8所示的下游引物msrb-r以及序列如seq?id?no.9所示的熒光探針msrb-p；

7、用于檢測無乳鏈球菌pg-mutase基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.10所示的上游引物pg-mutase-f、序列如seq?id?no.11所示的下游引物pg-mutase-r以及序列如seq?id?no.12所示的熒光探針pg-mutase-p；

8、用于檢測乙型溶血性鏈球菌is3基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.13所示的上游引物is3-f、序列如seq?id?no.14所示的下游引物is3-r以及序列如seq?id?no.15所示的熒光探針is3-p；

9、用于檢測伯克霍爾德氏菌16s?rrna基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.16所示的上游引物16s?rrna-f、序列如seq?id?no.17所示的下游引物16s?rrna-f以及序列如seq?id?no.18所示的熒光探針16s?rrna-p；

10、用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌spaa基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.19所示的上游引物spaa-f、序列如seq?id?no.20所示的下游引物spaa-r以及序列如seq?id?no.21所示的熒光探針spaa-p；

11、用于檢測諾卡菌seca1基因的引物探針包括：序列如seq?id?no.22所示的上游引物seca1-f、序列如seq?id?no.23所示的下游引物seca1-r以及序列如seq?id?no.24所示的熒光探針seca1-p；

12、用于檢測β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因tem的引物探針包括：序列如seq?id?no.25所示的上游引物tem-f、序列如seq?id?no.26所示的下游引物tem-r以及序列如seq?id?no.27所示的熒光探針tem-p；

13、用于檢測β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因shv的引物探針包括：序列如seq?id?no.28所示的上游引物shv-f、序列如seq?id?no.29所示的下游引物shv-r以及序列如seq?id?no.30所示的熒光探針shv-p；

14、用于檢測β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因ctx-m-9的引物探針包括：序列如seq?id?no.31所示的上游引物ctx-m-9-f、序列如seq?id?no.32所示的下游引物ctx-m-9-r以及序列如seqid?no.33所示的熒光探針ctx-m-9-p；

15、用于檢測甲氧西林耐藥基因meca的引物探針包括：序列如seq?id?no.34所示的上游引物meca-f、序列如seq?id?no.35所示的下游引物meca-r以及序列如seq?id?no.36所示的熒光探針meca-p；

16、用于檢測碳青霉烯酶耐藥基因kpc-2的引物探針包括：序列如seq?id?no.37所示的上游引物kpc-2-f、序列如seq?id?no.38所示的下游引物kpc-2-r以及序列如seq?idno.38所示的熒光探針kpc-2-p；

17、用于檢測萬古霉素耐藥基因vana的引物探針包括：序列如seq?id?no.40所示的上游引物vana-f、序列如seq?id?no.41所示的下游引物vana-r以及序列如seq?id?no.42所示的熒光探針vana-p；

18、用于檢測萬古霉素耐藥基因vanb的引物探針包括：序列如seq?id?no.43所示的上游引物vanb-f、序列如seq?id?no.44所示的下游引物vanb-r以及序列如seq?id?no.45所示的熒光探針vanb-p；

19、熒光探針的5’端標記熒光報告基團，熒光探針的3’端標記熒光猝滅基團。

20、可選地，所述引物探針組合物還包括用于檢測內(nèi)參rnasep基因的引物探針：序列如seq?id?no.46所示的上游引物rnasep-f1、序列如seq?id?no.47所示的下游引物rnasep-r1以及序列如seq?id?no.48所示的熒光探針rnasep-p1。

21、可選地，所述引物探針組合物中，所述熒光報告基團選自fam、rox、cy5、vic；熒光淬滅基團選自bhq1、bhq2、bhq3。

22、可選地，病原體基因的熒光報告基團選自fam、rox和vic，其熒光淬滅基團選自bhq1和bhq2；多個抗生素耐藥基因的熒光報告基團采用cy5，其熒光淬滅基團采用bhq3。

23、優(yōu)選地，熒光探針ybbj-p、mgrb-p和rnasp-p的5’端標記為報告基團fam，3’端標記為猝滅基團bhq1；熒光探針msrb-p、pg-mutase-p和is3-p的5’端標記為報告基團vic，3’端標記為猝滅基團bhq1；熒光探針16s?rrna-p、spaa-p、seca1-p的5’端標記為報告基團rox，3’端標記為猝滅基團bhq2；熒光探針tem-p、shv-p、ctx-m-9-p、meca-p、kpc-2-p、vana-p和vanb-p的5’端標記為報告基團cy5，3’端標記為猝滅基團bhq3。

24、第二方面，本技術還提供一種同時檢測皮膚軟組織感染相關病原體及其耐藥基因的試劑盒，其特征在于，包括前述的引物探針組合物。

25、可選地，所述試劑盒還包括：dna聚合酶、pcr反應buffer。

26、可選地，所述試劑盒還包括：陽性對照品、陰性對照品；所述陽性對照品包括攜帶各個基因的標準品重組質(zhì)粒；陰性對照品為te?buffer。

27、可選地，所述試劑盒還包括：樣本釋放劑。

28、所述樣本釋放劑包括以下含量的各成分：體積百分比為1～5％的吐溫20、體積百分比為3～7％的曲拉通x-100、1～5mm的異硫氰酸胍、5～15mm的三羥甲基氨基甲烷鹽和0.1～5mm的乙二胺四乙酸二鈉，余量為無菌水；樣本釋放劑ph為7.4±0.2。

29、優(yōu)選地，所述樣本釋放劑包括以下含量的各成分：體積百分比為2％的吐溫20、體積百分比為5％的曲拉通x-100、2mm的異硫氰酸胍、10mm的三羥甲基氨基甲烷鹽和1mm的乙二胺四乙酸二鈉，余量為無菌水；樣本釋放劑ph為7.4±0.2。

30、第三方面，本技術還提供上述的引物探針組合物在制備皮膚軟組織感染相關病原體及其耐藥基因的試劑盒的中的應用。

31、第四方面，本技術還提供一種同時檢測皮膚軟組織感染相關病原體及其耐藥基因的方法，其包括以下步驟：

32、s1、將采集的待測樣本進行預處理后加入到pcr反應管中，該pcr反應管中還含有如權利要求1所述的引物探針組合物以及pcr反應液，混勻后進行qpcr擴增；反應結(jié)束后，采集各通道的熒光信號，得到各通道的熔解曲線的tm值；

33、s2、根據(jù)pcr反應體系中的各通道的熔解曲線的tm值判斷待測樣本中是否含有各病原體。

34、可選地，s2步驟的具體分析判斷方法為：

35、當fam通道tm值在65±1時代表生物樣品中含有大腸桿菌；

36、當fam通道tm值在70±1時代表生物樣品中含有肺炎克雷伯氏菌；

37、當vic通道tm值在62±1時代表生物樣品中含有金黃色葡萄球菌；

38、當vic通道tm值在68±1時代表生物樣品中含有無乳鏈球菌；

39、當vic通道tm值在72±1時代表生物樣品中含有乙型溶血性鏈球菌；

40、當rox通道tm值在64±1時代表生物樣品中含有伯克霍爾德氏菌；

41、當rox通道tm值在68±1時代表生物樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌；

42、當rox通道tm值在70±1時代表生物樣品中含有諾卡菌；

43、當cy5通道tm值在70±1時代表生物樣品對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥；

44、當cy5通道tm值在63±1時代表生物樣品對甲氧西林耐藥；

45、當cy5通道tm值在59±1時代表生物樣品對碳青霉烯酶耐藥；

46、當cy5通道tm值在66±1時代表生物樣品對萬古霉素耐藥。

47、在上述基礎上，進一步優(yōu)選地，所述s2步驟的具體分析判斷方法還包括：

48、當fam通道tm值在72±1時代表生物樣品中檢測到人源基因，樣本取樣合格。

49、本發(fā)明的上述方法是基于qpcr熔解曲線法，通過各通道的熔解曲線的不同tm值針對不同的病原菌類型以及耐藥基因類型，從而通過tm值的具體數(shù)字從而判斷出對應的病原菌類型和耐藥基因。這種方法簡單易操作，效率高，可同步實現(xiàn)對8種皮膚軟組織感染相關病原體和7種不同耐藥基因的同步檢測，極大地簡化操作的同時，降低了樣本和試劑的使用量。

50、可選地，上述方法還包括以下步驟：

51、s3、基于各個目標基因的標準品重組質(zhì)粒的標準曲線，根據(jù)待測樣本的熒光擴增ct值即可得到待測樣品的目標病原體的含量。

52、上述方法不僅可定性測定樣品中的皮膚軟組織感染相關病原體的類型和耐藥基因，并且通過測定的待測樣本的熒光擴增ct值，還可同時得到感染的病原體濃度的定量檢測。

53、可選地，所述s1步驟中，待測樣本的預處理方法為：使用拭子擦拭皮膚軟組織感染患者的感染處皮膚軟組織，將采樣后拭子放入到樣本釋放劑中，渦旋混勻，室溫靜置后，上清液可作為pcr實驗的擴增模板。

54、可選地，混勻時間為20～50s，室溫靜置3～10min。

55、所述樣本釋放劑可采用現(xiàn)有的樣本釋放劑，用于快速處理待測樣本，釋放出樣本中的核酸，用于后續(xù)熒光pcr擴增。樣本釋放劑的可選方案見前述。

56、本發(fā)明具有以下有益效果：

57、1、本發(fā)明提供一種用于同時檢測皮膚軟組織感染相關病原體及其耐藥基因的引物探針組合物、試劑盒及檢測方法，該引物探針組合物及試劑盒可在一管內(nèi)同時檢測皮膚軟組織感染相關病原體大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、伯克霍爾德氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾卡菌這些病原菌，克服了臨床上現(xiàn)有檢測方法采用病原體培養(yǎng)所具有的敏感性低、時間長等缺陷。

58、2、本發(fā)明的qpcr熔解曲線法檢測靈敏度高，最低可穩(wěn)定檢出500或1000copies/ml的病原體核酸，且該方法能特異的檢測大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、伯克霍爾德氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾卡菌的種類以及定量測定其樣品中的含量，并且其與沙門氏菌、志賀氏菌、鮑曼不動桿菌、嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、肺炎鏈球菌、表皮葡萄球菌等其他樣本均無交叉反應，特異性好。

59、3、本技術的上述試劑盒及檢測方法在檢測病原體類型的同時還實現(xiàn)了單熒光通道對四種常見耐藥類型基因(超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、甲氧西林、碳青霉烯酶、萬古霉素)的七種耐藥基因(tem、shv、ctx-m-9、meca、kpc-2、vana、vanb)的檢測，基因檢測覆蓋范圍廣，操作人員可根據(jù)tm值判斷耐藥類型，為臨床指導用藥提供了高效便捷的方法。

60、4、本發(fā)明的上述方法提供了一種針對皮膚軟組織感染的樣本處理方法，無需采血進行檢測，且不需要進行復雜的樣本核酸提取純化，僅需樣本釋放劑處理采樣拭子幾分鐘，即可將上清液作為模板進行后續(xù)實驗，極大縮短了樣本處理的時間。

61、5、本發(fā)明所述的檢測方法特異性強、靈敏度高、高效、安全，對樣本中含有的微量大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、伯克霍爾德氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾卡菌基因組及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、甲氧西林、碳青霉烯酶、萬古霉素耐藥基因的檢測效果良好，可用于上述多種病原體及耐藥基因的臨床檢測和分子流行病學調(diào)查，為大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、伯克霍爾德氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾卡菌這些皮膚軟組織感染相關病原體及其上述多種耐藥基因的pcr商業(yè)診斷試劑盒研制奠定了基礎。