本發(fā)明涉及動物病毒檢測，尤其涉及一種基于納米孔測序的禽白血病毒全基因組的擴增引物和方法。

背景技術：

1、禽白血病(avian?leukosis，al)由禽白血病毒(avian?leukosis?virus,alv)引起，alv是一種致癌性逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有感染率高，發(fā)病率低等特點。根據(jù)其臨床癥狀及腫瘤類型可分為淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成髓細胞白血病和髓細胞樣白血病等，其中以淋巴性白血病最常見。20世紀50年代，禽白血病在我國甘肅省首次被發(fā)現(xiàn)，迅速蔓延到了各個省份。1999年在我國商品肉雞中首次檢出alv-j，病原學說明其是從國外引進的白羽肉種雞傳入。隨后，山東、江蘇、寧夏等多地陸續(xù)報道了白羽肉雞alv-j的感染。隨著我國各地方雞引種雜交的開始，許多地方優(yōu)良品種中也暴發(fā)了alv-j。目前，我國alv感染主要以alv-a、alv-b和alv-j為主，其中，alv-j在各地雞群中的流行情況最為嚴重。近年來，從我國地方品種雞又陸續(xù)分離出一個新亞群alv-k，這導致我國alv的感染情況越來越復雜，給禽白血病防控帶來新挑戰(zhàn)。

2、alv屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，復制過程容易發(fā)生基因變異與重組，引起其抗原性、生物學特性及致病性發(fā)生改變。近年來alv一直處于快速變異和進化中，對alv感染進行快速鑒別診斷，并獲得其基因組信息，能為病毒早發(fā)現(xiàn)、早控制、溯源提供依據(jù)，盡可能減小其對養(yǎng)禽業(yè)帶來的經(jīng)濟損失。納米孔測序具有實時、便攜、長讀長、高通量等特點，可實現(xiàn)現(xiàn)場實時快速檢測，及時準確鑒別病原體，給出精準檢測結(jié)果。然而，目前尚無針對納米孔測序優(yōu)勢設計的alv的測序技術。因此，目前仍亟需一種基于三代納米孔測序的alv全基因組測序技術，快速獲得病原體全基因組序列，為病毒遺傳變異和流行病學分析提供重要參考和理論依據(jù)。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明設計了alv全基因組長pcr擴增特異性引物，并進一步提供一種納米孔測序的alv實時檢測方法，充分發(fā)揮納米孔測序在病原檢測中實時、便攜、長讀長、高通量等優(yōu)勢。該檢測方法可快速鑒別診斷alv的感染，同時得到其全基因組序列，獲得的全基因組序列可為病原變異監(jiān)控及分子流行病學研究提供信息。

2、為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術方案為：

3、一方面，本發(fā)明提供一種禽白血病毒的檢測引物組，所述檢測引物組包括18對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～36所示。

4、另一方面，本發(fā)明提供上述檢測引物組在制備檢測白血病病毒的產(chǎn)品中的應用。

5、進一步地，所述產(chǎn)品包括試劑或試劑盒。

6、另一方面，本發(fā)明提供一種禽白血病毒的檢測試劑，包括上述檢測引物組。

7、進一步地，所述檢測試劑包括第一引物組和第二引物組，其中，第一引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～18所示；第二引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.19～36所示。

8、另一方面，本發(fā)明提供一種禽白血病毒的檢測試劑盒，包括上述檢測引物組。

9、進一步地，所述檢測試劑盒包括第一引物組和第二引物組，其中，第第一引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～18所示；第二引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.19～36所示。

10、另一方面，本發(fā)明提供一種禽白血病毒測序片段的制備方法，利用上述檢測引物組對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段。

11、進一步地，利用第一引物組和第二引物組分別對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段；

12、其中，第一引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～18所示；第二引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.19～36所示。

13、進一步地，測序樣本適用于二代或三代測序。

14、進一步地，待檢測樣本包括臨床樣本或環(huán)境樣本。

15、優(yōu)選地，臨床樣本包括胎糞、蛋清和精液或血漿等。

16、進一步地，上述檢測步驟包括：

17、1)利用上述引物組對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段。

18、2)利用第一引物組和第二引物組分別對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行多重pcr擴增；其中，第一引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～18所示；第二引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.19～36所示。

19、3)將兩組引物的擴增產(chǎn)物合并，經(jīng)純化得到測序片段。

20、4)測序獲得禽白血病毒的基因組片段序列。

21、5)經(jīng)與參考基因組比對和/或組裝獲得禽白血病毒的基因組全長序列。

22、進一步地，所述禽白血病毒的非疾病診斷檢測為檢測環(huán)境樣本或無生命的生物個體的胎糞、蛋清和精液或血漿樣本。

23、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

24、根據(jù)美國生物技術信息中心基因序列數(shù)據(jù)庫genbank中已公開的alv的全基因組序列，按照基因組位置設計得到18對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～36所示。本發(fā)明的檢測方法可獲取alv全基因組序列信息。本發(fā)明利用納米孔測序?qū)崟r、便攜、長讀長、高通量的優(yōu)勢，實現(xiàn)快速鑒別診斷alv的感染，最快15h；同時得到其全基因組序列，獲得的基因組序列能為病毒溯源、病原變異追蹤、新型毒株識別和預警等提供科學依據(jù)。

技術特征：

1.一種禽白血病病毒的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組包括18對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～36所示。

2.權(quán)利要求1所述的檢測引物組在制備檢測禽白血病病毒的產(chǎn)品中的應用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括試劑或試劑盒。

4.一種禽白血病病毒的檢測試劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的檢測引物組。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑包括第一引物組和第二引物組，其中，第一引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～18所示；第二引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.19～36所示。

6.一種禽白血病病毒的檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的檢測引物組。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括第一引物組和第二引物組，其中，第一引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～18所示；第二引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.19～36所示。

8.一種禽白血病病毒測序片段的制備方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的檢測引物組對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，利用第一引物組和第二引物組分別對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段；其中，第一引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～18所示；第二引物組包括9對擴增引物，具體序列如seq?id?no.19～36所示。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述測序樣本適用于三代測序。

11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述待檢測樣本包括臨床樣本或環(huán)境樣本。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述臨床樣本包括胎糞、蛋清和精液或血漿。

技術總結(jié)
本發(fā)明提供了一種禽白血病病毒全基因組的擴增引物和方法。禽白血病病毒的檢測引物組包括18對擴增引物，具體序列如SEQ?ID?NO.1～36所示。本發(fā)明提供的檢測引物組可以實現(xiàn)對禽白血病病毒的較均勻覆蓋，在納米孔測序中，實現(xiàn)了基因組100％區(qū)域覆蓋。本發(fā)明提供的禽白血病病毒全基因組的測序片段制備方法簡便易操作，擴增效果好，且納米孔測序具有邊測序邊實時分析的優(yōu)勢，可以大大縮短檢測時間，能快速鑒別診斷禽白血病病毒的感染，同時得到其全基因組序列，獲得的基因組序列能為病毒溯源、病原變異追蹤、新型毒株識別和預警等提供科學依據(jù)。

技術研發(fā)人員：林麗苗,李群輝,趙海參,盧立康,麥凱杰,羅洋洋,任柏樺,王連想
受保護的技術使用者：溫氏食品集團股份有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/23