本發(fā)明涉及生物中一種通過抑制水稻中ostrxh1基因的表達(dá)提高水稻稻瘟病抗性的方法。

背景技術(shù)：

1、稻瘟病是水稻生產(chǎn)中的重要真菌病害，嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量和品質(zhì)，威脅糧食安全。培育抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，r基因賦予水稻較高的抗性，也一直是科學(xué)家研究的熱點。但是r基因在育種中也存在一些問題，如大部分r基因抗譜較窄，在高選擇壓下，小種變異加快，導(dǎo)致抗性品種在幾年內(nèi)喪失抗性。多個r基因疊加雖然能增加抗譜，降低被快速克服的概率，但是也通常會引起產(chǎn)量或品質(zhì)的代償作用。因此，需要挖掘抗譜寬，且對產(chǎn)量影響較小的基因資源。

2、近年來，crispr/cas9基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，該系統(tǒng)可以利用一段短rna(single-guide?rna,sgrna)引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶cas9對靶序列進(jìn)行切割，實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的突變，大大拓展了研究人員對基因功能的研究，被science評為2013年度十大科技進(jìn)展之一。目前，該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于水稻、水稻、高粱、玉米等糧食作物，為保障糧食安全和創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品提供了新的契機。

3、在植物與病原菌互作過程中，病原菌分泌的效應(yīng)蛋白通過不同的方式“劫持”或“利用”植物基因，最終實現(xiàn)對植物的進(jìn)一步侵染，這類植物基因被稱為感病基因(s基因)。如果效應(yīng)蛋白在不同的病原菌中保守，可能調(diào)控不同的病害。利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)對這類s基因進(jìn)行突變，可使植物獲得對多種病原菌的抗性，這些基因多數(shù)情況下不影響作物的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀，這也成為一種新的培育抗病品種的方法。目前已報道多個感病基因，如水稻tapsipk1是一個感病基因，crispr/cas9介導(dǎo)的tapsipk1基因編輯突變體可以在不影響農(nóng)藝性狀的情況下，增強水稻對條銹病的廣譜抗性。此外，玉米的zmnanmt、水稻的rod1、番茄的sldmr6-1也被證明是感病基因，這些基因突變后均能賦予植物對不同病原菌的抗性。綜上所述，挖掘更多的感病新基因，解析相關(guān)作用通路，可以為通過基因編輯技術(shù)獲得抗病植物新品種提供候選基因資源。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高水稻對稻瘟病的抗性。

2、為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個目的是提供了一種提高水稻稻瘟病抗性的方法，包括如下步驟：抑制受體水稻中ostrxh1基因的表達(dá)，得到稻瘟病抗性高于所述受體水稻的目的水稻；所述ostrxh1基因為編碼ostrxh1蛋白的基因；所述ostrxh1蛋白是如下a1、a2或a3的蛋白質(zhì)：

3、a1、氨基酸序列是序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；

4、a2、將序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與a1所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且與水稻稻瘟病抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)；

5、a3、在a1或a2的n末端或/和c末端連接蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

6、上述方法中，所述蛋白質(zhì)標(biāo)簽(protein-tag)是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白質(zhì)一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白質(zhì)，以便于目的蛋白質(zhì)的表達(dá)、檢測、示蹤和/或純化。所述蛋白質(zhì)標(biāo)簽可為flag標(biāo)簽、his標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、gst標(biāo)簽和/或sumo標(biāo)簽等，部分可用標(biāo)簽的氨基酸序列見表1。

7、表1標(biāo)簽的序列

8、 標(biāo)簽 殘基 序列 poly-arg 5-6(通常為5個) rrrrr poly-his 2-10(通常為6個) hhhhhh flag 8 dykddddk strep-tag?ii 8 wshpqfek c-myc 10 eqkliseedl

9、上述方法中，seq?id?no.2由122個氨基酸殘基組成。

10、上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性?？墒褂脟H互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點測定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索一對氨基酸序列的同一性進(jìn)行計算，然后即可獲得同一性的值(％)。

11、上述方法中，所述80％以上的同一性可為至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

12、上述方法中，所述提高水稻稻瘟病抗性，具體可表現(xiàn)為感染稻瘟病病原菌后目的水稻葉片上的病斑長度(病斑面積)較受體水稻短(小)，目的水稻葉片上稻瘟病病原菌生物量較受體水稻少。

13、上述方法中，所述ostrxh1基因具體可為如下e1或e2所示的基因：

14、e1、編碼鏈的編碼序列是seq?id?no.1的dna分子；

15、e2、核苷酸序列是seq?id?no.3第3001-4990位的dna分子。

16、上述方法中，所述抑制水稻中ostrxh1基因的表達(dá)是通過對受體水稻中ostrxh1基因進(jìn)行基因編輯實現(xiàn)的。所述基因編輯是借助crispr/cas9系統(tǒng)實現(xiàn)的。

17、上述方法中，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括表達(dá)含有cas9和sgrna的載體，所述sgrna的靶序列為序列表中seq?id?no.3第3119-3138位和seq?id?no.3第4330-4349位。

18、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了抗稻瘟病的植物試劑，所述試劑的活性成分為抑制編碼所述ostrxh1蛋白的基因的表達(dá)、降低所述ostrxh1蛋白的豐度、和/或敲除編碼所述ostrxh1蛋白的基因的物質(zhì)。

19、上述抗稻瘟病的試劑中，所述物質(zhì)含有下述f1、f2或f3：

20、f1、靶向所述基因的sgrna、sirna、shrna、mirna或反義rna；

21、f2、產(chǎn)生靶向所述基因的sgrna的dna分子、產(chǎn)生靶向所述基因的sirna的dna分子、產(chǎn)生靶向所述基因的shrna的dna分子、產(chǎn)生靶向所述基因的mirna的dna分子或產(chǎn)生靶向所述基因的反義rna的dna分子；

22、f3、產(chǎn)生靶向所述基因的sgrna的表達(dá)載體、產(chǎn)生靶向所述基因的sirna的表達(dá)載體、產(chǎn)生靶向所述基因的shrna的表達(dá)載體、產(chǎn)生靶向所述基因的mirna的表達(dá)載體或產(chǎn)生靶向所述基因的反義rna的表達(dá)載體。

23、上述抗稻瘟病的試劑的活性成分還可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述藥劑的其他活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)植物的抗病效果確定。

24、本發(fā)明還提供ostrxh1蛋白，所述ostrxh1蛋白是如下a1、a2或a3的蛋白質(zhì)：

25、a1、氨基酸序列是序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；

26、a2、將序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與a1所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且與水稻稻瘟病抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)；

27、a3、在a1或a2的n末端或/和c末端連接蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

28、本發(fā)明還提供與ostrxh1蛋白相關(guān)的生物材料，為下述b1至b5中的任一種：

29、b1、編碼所述蛋白質(zhì)ostrxh1的核酸分子；

30、b2、含有b1所述核酸分子的表達(dá)盒；

31、b3、含有b1所述核酸分子的重組載體、或含有b2所述表達(dá)盒的重組載體；

32、b4、含有b1所述核酸分子的重組微生物、或含有b2所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有b3所述重組載體的重組微生物；

33、b5、含有b1所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織或轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有b2所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織或轉(zhuǎn)基因植物器官。

34、其中，所述核酸分子可以是dna分子，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna分子，如mrna或hnrna等。

35、上述生物材料中，b1所述核酸分子為如下e1或e2所示的基因：

36、e1、編碼鏈的編碼序列是seq?id?no.1的dna分子；

37、e2、核苷酸序列是seq?id?no.3第3001-4990位的dna分子。

38、本發(fā)明還保護(hù)crispr/cas9系統(tǒng)，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括表達(dá)含有cas9和sgrna的載體，所述sgrna的靶序列為序列表中seq?id?no.3第3119-3138位和seq?id?no.3第4330-4349位。

39、接種實驗表明，與受體水稻相比，ostrxh1敲除水稻株系對稻瘟病的抗性增強，ostrxh1過表達(dá)水稻株系對稻瘟病的抗性減弱，說明ostrxh1是與植物抗病相關(guān)的基因。本發(fā)明的方法操作簡單，成本低，大大加快了育種進(jìn)程，具有廣泛的應(yīng)用前景。