本發(fā)明屬于病毒檢測，尤其涉及一種用于檢測鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr引物探針組、檢測體系和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在水禽的日常飼養(yǎng)中，鴨坦布蘇病毒(dtmuv)、新型鴨呼腸孤病毒(ndrv)、鴨甲型肝炎病毒1型(dhav-1)和鴨甲型肝炎病毒3型(dhav-3)較為常見。鴨坦布蘇病毒(dtmuv)屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種ntaya病毒群的正義單鏈rna病毒。該病具有發(fā)病快、傳播快、流行率高的特點。它主要導(dǎo)致鴨的產(chǎn)蛋量迅速下降甚至停止。在疾病的早期階段，鴨子可能持續(xù)高燒，隨后出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如癱瘓、滾動、站立不穩(wěn)和共濟失調(diào)。發(fā)病率可達100％，但死亡率較低，為5％～15％。2010年4月以來，dtmuv頻頻在多地區(qū)暴發(fā)，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。新型鴨呼腸孤病毒(ndrv)屬于呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬。它的顆粒直徑為70至80納米，其基因組由10段雙鏈rna組成。自2017年以來，ndrv在多地相繼爆發(fā)，與先前報道的鴨呼腸孤病毒相比，ndrv表現(xiàn)出更高的致病性、更廣泛的宿主范圍和更高的死亡率。ndrv可感染不同種類的鴨和鵝，引起肝、脾和法氏囊出血性壞死，它還可導(dǎo)致卵巢出血和卵巢卵泡萎縮，這些疫情給養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。鴨甲型肝炎病毒(dhav)屬于小核糖核酸病毒科和腸道病毒屬。它是一種帶有非包膜球形病毒顆粒的單鏈陽性rna病毒。1945年，萊文和霍夫斯塔德首次發(fā)現(xiàn)了鴨病毒性肝炎。該病的特點是肝臟腫大和出血，雛鴨在一周內(nèi)發(fā)病，出現(xiàn)癥狀后迅速死亡。由于dhav毒株間遺傳差異顯著且不存在交叉反應(yīng)性，因此將dhav分為dhav-1、dhav-2和dhav-3。到目前為止，在我國流行的主要毒株是dhav-1和dhav-3。

2、dtmuv、ndrv、dhav-1和dhav-3是鴨子常見的病原體，由于dtmuv、ndrv、dhav-1和dhav-3具有臨床免疫抑制特性，它們相互或與其他病毒聯(lián)合可引起繼發(fā)性或多重感染。僅根據(jù)臨床癥狀診斷來確定是否發(fā)生某些疾病是具有挑戰(zhàn)性的。近年來，pcr和實時qpcr等核酸檢測技術(shù)作為一種方便、準確的檢測手段被廣泛應(yīng)用于此類疾病的診斷。然而，這些分子技術(shù)是基于使用不同的pcr方法檢測不同的病原體，這些方法針對單個物種特異性基因，而不是同時在一個反應(yīng)中進行。因此，目前缺乏同時檢測四種病毒的研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr引物探針組，所述引物探針組可同時檢測4種水禽傳染病病原，4種病原間無交叉反應(yīng)，且穩(wěn)定性高。

2、本發(fā)明的目的還在于提供一種鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr檢測體系。

3、本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr試劑盒。

4、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

5、本發(fā)明提供了一種用于檢測鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr引物探針組，所述引物探針組包括檢測鴨坦布蘇病毒的上游引物dtmuv-f、下游引物dtmuv-r和熒光探針dtmuv-probe；檢測鴨呼腸孤病毒的上游引物ndrv-f、下游引物ndrv-r和熒光探針ndrv-probe；檢測鴨甲型肝炎病毒1型的上游引物dhav-1-f、下游引物dhav-1-r和熒光探針dhav-1-probe以及檢測鴨甲型肝炎病毒3型的上游引物dhav-3-f、下游引物dhav-3-r和熒光探針dhav-3-probe；

6、所述檢測鴨坦布蘇病毒的上游引物dtmuv-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，下游引物dtmuv-r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，熒光探針dtmuv-probe的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

7、所述檢測鴨呼腸孤病毒的上游引物ndrv-f的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，下游引物ndrv-r的核苷酸序列如seq?id?no.8，熒光探針ndrv-probe的核苷酸序列如seq?idno.9所示；

8、所述檢測鴨甲型肝炎病毒1型的上游引物dhav-1-f的核苷酸序列如seq?id?no.12所示，下游引物dhav-1-r的核苷酸序列如seq?id?no.13所示，熒光探針dhav-1-probe的核苷酸序列如seq?id?no.14所示；

9、所述檢測鴨甲型肝炎病毒3型的上游引物dhav-3-f的核苷酸序列如seq?id?no.18所示，下游引物dhav-3-r的核苷酸序列如seq?id?no.19所示，熒光探針dhav-3-probe的核苷酸序列如seq?id?no.20所示。

10、優(yōu)選地，所述引物探針組中熒光探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光猝滅基團。

11、優(yōu)選地，所述熒光報告基團包括hex、cy5、rox或fam中的一種；所述熒光猝滅基團包括bhq1或bhq2。

12、本發(fā)明還提供了一種用于檢測鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr試劑盒，所述試劑盒包含所述的多重qpcr引物探針組。

13、本發(fā)明還提供了一種鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr的檢測體系，所述多重qpcr的檢測體系包含所述的多重qpcr引物探針組。

14、優(yōu)選地，所述多重qpcr的檢測體系以20μl總體積計，包括如下組分：10μlone?stepprimescript?qpcrmix，混合模板2μl，8～12μm的上游引物dtmuv-f0.5μl，8～12μm的下游引物dtmuv-r?0.5μl，8～12μm的熒光探針dtmuv-probe0.5μl；8～12μm的上游引物ndrv-f?0.8μl，8～12μm的下游引物ndrv-r?0.7μl，8～12μm的熒光探針ndrv-probe?0.8μl；8～12μm的上游引物dhav-1-f?0.3μl，8～12μm的下游引物dhav-1-r?0.3μl，8～12μm的熒光探針dhav-1-probe?0.2μl；8～12μm的上游引物dhav-3-f?0.6μl，8～12μm的下游引物dhav-3-r?0.6μl，8～12μm的熒光探針dhav-13-probe?0.7μl；1.6μl?ddh2o。

15、優(yōu)選地，所述混合模板中鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型四種病原模板按等體積比混合。

16、本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨甲型肝炎病毒1型和鴨甲型肝炎病毒3型的多重qpcr檢測方法，包括如下步驟：

17、提取待檢樣品的rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna；

18、以上述cdna為模板，利用所述的多重qpcr引物探針組，或所述的試劑盒，或所述的檢測體系進行多重qpcr擴增；

19、反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線情況判斷待檢樣品中dtmuv、ndrv、dhav-1和dhav-3是否為陽性。

20、優(yōu)選地，所述判斷標準如下：若待測樣品檢測出現(xiàn)擴增曲線且ct≤35，則判定為陽性；若待測樣品未檢測出擴增曲線或ct值>38，則判定為陰性。

21、優(yōu)選地，所述多重qpcr擴增的反應(yīng)程序如下：反轉(zhuǎn)錄25℃、10min，52℃、5min；預(yù)變性95℃、30s；變性95℃、5s，退火52℃、30s，延伸72℃、20s，40個循環(huán)。

22、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

23、本發(fā)明提供了一種檢測鴨坦布蘇病毒dtmuv、鴨呼腸孤病毒ndrv、鴨甲型肝炎病毒1型dhav-1和鴨甲型肝炎病毒3型dhav-34種水禽傳染病病原的引物探針組，所述引物探針組對4種水禽傳染病病原進行檢測，具有良好的特異性與靈敏度，相較于目前應(yīng)用較多的pcr檢測、病原分離鑒定和血清學(xué)檢測，具有相當(dāng)?shù)臋z測靈敏度。本發(fā)明所述引物探針組可同時檢測4種水禽傳染病病原，4種病原間無交叉反應(yīng)，且穩(wěn)定性高，其變異系數(shù)都在10％以下。本發(fā)明還建立了同時檢測dtmuv、ndrv、dhav-1和dhav-3的多重qrt-pcr體系和方法，利用本發(fā)明提供的多重qrt-pcr檢測體系和方法可以快速檢測出dtmuv、ndrv、dhav-1和dhav-3這四種病毒，可以為這四種病毒提供有效的預(yù)防，有望減少水禽養(yǎng)殖上的經(jīng)濟損失。